一种优化的葡萄金黄化植原体检测DNA提取方法：HotShot Vitis的开发与验证

《Plant Methods》：An optimized DNA extraction protocol for reliable PCR-based detection and characterization of grapevine flavescence dorée phytoplasma

本研究针对葡萄金黄化植原体(FDp)检测中DNA提取方法存在的效率低、成本高、抑制剂干扰等问题，开发了名为"HotShot Vitis"(HSV)的新型DNA提取方法。研究人员通过对比CTAB法和商业试剂盒，证明HSV方法能在30分钟内完成提取，支持FDp的qPCR检测、分子分型和测序分析，为葡萄病害早期诊断提供了快速可靠的解决方案。

　　

在欧洲葡萄园中，一种名为"葡萄金黄化"(Flavescence dorée, FD)的毁灭性病害正悄然蔓延，这种由葡萄金黄化植原体(Grapevine flavescence dorée phytoplasma, FDp)引起的病害已被列为检疫性病原体，对葡萄产业构成严重威胁。由于缺乏抗病品种和根治方法，病害防控完全依赖于早期准确的检测技术。分子诊断技术特别是PCR方法虽然是金标准，但其准确性高度依赖于DNA提取质量——这正是当前面临的核心挑战。

葡萄组织中含有丰富的多糖和多酚等PCR抑制剂，传统CTAB方法虽能获得高质量DNA但耗时长达2小时，商业试剂盒虽纯度较高但成本昂贵且DNA得率低。这种两难境地促使研究人员寻求一种既快速又可靠的DNA提取新方案。

如图1所示，感染FDp的葡萄植株表现出明显的生长受阻和叶片异常症状，这凸显了早期准确诊断的紧迫性。正是在这样的背景下，Carli等研究人员在《Plant Methods》上发表了他们的创新成果——"HotShot Vitis"(HSV)方法，为这一难题提供了优雅的解决方案。

关键技术方法

研究团队于2024年8月从意大利托斯卡纳地区已有FD感染报告的葡萄园中采集了桑娇维塞品种的叶片样本，包括有症状和无症状植株。他们开发了HSV方法，该方法基于HotSHOT原理进行优化，使用含有PVP-40、SDS和亚硫酸氢钠的碱性缓冲体系，通过95°C加热10分钟实现快速裂解。研究人员将HSV方法与传统CTAB法和商业硅胶膜试剂盒进行系统比较，评估指标包括DNA提取效率、FDp检测灵敏度、分子分型能力以及操作时间效率。所有检测均采用qPCR和终点PCR方法，针对16S rRNA基因和map基因进行扩增和测序分析。

FDp在症状葡萄中的检测与亚型鉴定

田间采样识别出3株有症状和3株无症状的葡萄植株。有症状植株表现出生长受阻、丛生外观、早期叶片红化和向下卷曲等典型FD症状。诊断检测确认所有有症状植株(100%)存在16SrV植原体，而无症状植株均为阴性。通过16S rRNA和map基因的终点PCR扩增，研究人员发现这些分离株属于16SrV-C亚组和map-FD3基因型，与之前意大利报道的FDp分离株具有100%的序列一致性。

HSV支持内源基因扩增但不适用于常规DNA定量

如图2所示，HSV方法提取的DNA在琼脂糖凝胶电泳中未显示明显条带，且分光光度计定量结果不可靠(约-347 ng/μL)，这主要是由于缓冲液成分(去污剂、高pH值)干扰了检测系统。相比之下，CTAB法产量最高(27-34 ng/μL)，商业试剂盒产量较低(3-4 ng/μL)但纯度良好。然而，针对葡萄叶绿体trnL-F间隔区的qPCR分析显示，所有方法都获得了可比较的Ct值(平均Ct=15)，证明HSV提取的DNA完全适用于分子分析。

HSV通过qPCR实现可靠的FDp检测

FDp检测使用两种独立的qPCR方法进行评估。只有阳性样本(HSV+、CTAB+、KIT+)产生扩增信号，而所有阴性对照均未检测到。HSV+样本在10^-1至10^-6稀释度范围内显示可靠的扩增，Ct值从21升至35。值得注意的是，未稀释样本(10⁰)没有扩增，可能是由于SDS和NaCl等PCR抑制剂的干扰，稀释后成功消除了这种抑制效应。

图3展示了使用HSV方法提取的DNA进行qPCR检测的扩增曲线，证明了该方法在适当稀释条件下的检测可靠性。CTAB+和KIT+样本也显示出类似的稀释依赖性扩增趋势，两种qPCR方法的结果具有良好的一致性。

HSV DNA提取物支持分子分型和测序

成功通过qPCR验证后，研究人员评估了HSV提取的DNA在FDp分子分型中的适用性。16S rRNA和map基因从未稀释和1:10稀释的HSV、CTAB和KIT提取的DNA中均成功扩增。

图4和图5分别展示了16S rRNA基因和map基因的扩增结果。对于map基因，只有稀释样本从HSV和KIT提取物中获得了完整的750 bp序列，而CTAB在未稀释和稀释条件下均成功。测序色谱图质量高，峰形尖锐，背景噪音低，特别是稀释样本的表现更为优异。

图6展示了使用HSV提取方法获得的测序色谱图部分，证明了该方法的可靠性。生物信息学分析确认所有序列与已知FDp分离株匹配：16S rRNA基因为FD-C(AB639101)，map基因为DicTos27(PP196536)(map-FD3，M51基因型)。这些结果表明1:10稀释是HSV提取物的最佳选择，与之前关于map基因扩增的建议一致。

HSV提供最省时且低化学风险的DNA提取方案

三种DNA提取方法的时间效率评估显示，HSV所需处理时间最短，仅需约30分钟。KIT方案耗时约40分钟，而CTAB方法需要近两小时。CTAB方法耗时较长反映了其多步骤性质，而KIT方法虽然相对简单，仍涉及多个缓冲液和离心步骤。相比之下，HSV方案仅依赖两种缓冲液、单一加热步骤和直接的处理流程，导致更快的周转时间和降低的操作复杂性。

更重要的是，HSV采用了简化的缓冲系统，避免了有机溶剂和危险试剂，如酚、氯仿、β-巯基乙醇或专利化学品，这些物质具有毒性、腐蚀性，需要严格的安全预防措施。这种化学安全性优势使HSV成为常规DNA提取的更安全选择。

研究结论与意义

本研究开发的HotShot Vitis(HSV)方法成功解决了葡萄金黄化植原体检测中DNA提取的三大核心问题：速度、成本和抑制剂干扰。虽然HSV提取物与传统分光光度法定量方法不兼容，但在所有下游分子分析中表现稳健，特别是支持FDp的高灵敏度qPCR检测、分子分型和测序分析。

HSV最显著的优势在于其极短的处理时间(约30分钟)和低化学风险特性，使其特别适合大规模葡萄园监测项目。该方法能够同时处理大量样本(三小时内可达120个样本)，远超传统方法的处理能力，为FD的早期发现和及时管理提供了强有力的技术支持。

这项研究不仅为葡萄植原体病害诊断提供了实用的技术方案，更重要的是展示了一种针对特定作物-病原体系列优化DNA提取方法的创新思路。HSV方法的成功开发将有助于提升葡萄金黄化的防控效率，减少病害造成的经济损失，对保障葡萄产业的可持续发展具有重要实践意义。随着该方法在更广泛地区的应用验证，有望成为葡萄植原体病害诊断的新标准。