NR2F1-MACF1-WNT信号轴调控肺腺癌黏附斑形成及转移的机制研究

《European Journal of Medical Research》：Transcriptional activation of MACF1 by NR2F1 drives WNT-mediated focal adhesion and metastasis in lung adenocarcinoma

本刊推荐：为阐明肺腺癌（LUAD）转移新机制，研究人员开展"NR2F1转录激活MACF1驱动WNT介导的黏附斑形成"主题研究。通过体内外实验证实NR2F1-MACF1-CTNNB1信号轴通过促进β-连环蛋白核转位上调黏附斑基因（Paxillin/FAK/ITGB1），揭示该轴可作为抗转移治疗新靶点。研究为LUAD治疗提供全新理论依据。

　　

肺腺癌作为非小细胞肺癌中最常见的病理类型，其发病率和死亡率近年来持续攀升。尽管靶向治疗和免疫治疗的发展在一定程度上改善了肺腺癌患者的预后，但对于局部晚期或转移性肺腺癌患者而言，治疗效果仍不理想。高转移率和获得性耐药成为临床面临的主要挑战，因此深入解析肺腺癌细胞迁移、黏附和侵袭的分子机制，对于开发新的治疗策略至关重要。

在肿瘤转移级联反应中，肿瘤细胞从原发灶脱离，改变与细胞外基质的相互作用，并经历细胞骨架重塑以增强运动能力。这一过程使肿瘤细胞能够突破基底膜，进入循环系统，最终形成远处转移。黏附斑作为细胞与细胞外基质相互作用和迁移的主要结构，由跨膜整合素和细胞内衔接蛋白（如Paxillin、黏附斑激酶FAK和Talin）组成。这些结构不仅将细胞物理锚定在细胞外基质上，还传递协调细胞骨架动力学和细胞运动的生化信号。虽然已知黏附斑激活能够促进癌细胞的侵袭性和转移潜能，但在肺腺癌中控制黏附斑组装的上述调控元件仍知之甚少。

微管肌动蛋白交联因子1（MACF1，亦称ACF7）是一种巨大的斑蛋白，能同时结合微管和丝状肌动蛋白。研究表明MACF1在胚胎发育、上皮极性建立、伤口愈合和神经元迁移中发挥重要作用。近期研究提示MACF1参与细胞骨架动力学和细胞运动，但其在肺腺癌进展中的具体功能尚未充分探索。MACF1是否在肿瘤转移过程中调控黏附斑组装，此前尚未有研究报道。

另一方面，经典Wnt/β-连环蛋白信号通路因其在肿瘤发生和发展中的核心作用而广为人知。关键效应分子CTNNB1（β-连环蛋白）在通路激活后转位入核，与LEF/TCF转录因子结合诱导下游靶基因表达。Wnt通路的持续激活与上皮间质转化（EMT）、肿瘤干性和转移密切相关。值得注意的是，多个Wnt靶基因如ZEB1、CD44和FN1与肿瘤细胞的黏附和迁移行为相关。然而，MACF1是否参与Wnt信号调控并进而影响黏附斑组装，在肺腺癌中尚未得到实验证实。

此外，核受体NR2F1（核受体亚家族2，F组成员1）被报道在多种肿瘤环境中调控细胞休眠和耐药性。然而，其在肺腺癌中的功能仍 largely 不明确。特别是，NR2F1是否作为MACF1表达的上游转录调控因子尚属未知。因此，阐明涉及MACF1及其上游调控因子的转录和信号网络对于理解肺腺癌转移和识别新的治疗靶点至关重要。

本研究通过体外功能获得和缺失实验（利用shRNA介导的敲低和异位过表达MACF1和NR2F1）、CCK-8、EdU、结晶紫和Transwell实验评估细胞增殖、黏附和迁移，结合皮下和尾静脉移植瘤模型评估体内肿瘤生长和转移，并采用RNA测序、GSEA、核质分离、双荧光素酶报告基因实验、免疫荧光、ChIP-qPCR和ENCODE数据库分析等技术方法，系统揭示了NR2F1-MACF1-WNT轴在肺腺癌中的关键作用。

MACF1促进肺腺癌细胞黏附斑形成

研究人员首先在H1299和Calu-3细胞中敲低MACF1，发现其表达沉默后细胞生长和DNA复制能力显著抑制。通过qPCR和Western blot检测发现黏附斑相关基因Paxillin、FAK和ITGB1表达显著下调。明胶包被板黏附实验显示MACF1缺陷细胞黏附能力降低，免疫荧光染色揭示Paxillin膜定位减少。Transwell迁移实验进一步证实MACF1敲低显著损害细胞迁移能力。

MACF1敲低损害体内肿瘤生长和转移

通过皮下注射MACF1敲低细胞建立移植瘤模型，发现MACF1缺陷肺腺癌细胞肿瘤生长速率显著降低。异种移植瘤显示KI67和CTNNB1染色明显减少。尾静脉注射建立肺转移模型发现MACF1敲低组肺组织转移结节数量显著减少，转移灶中FAK、ITGB1和Paxillin表达水平显著降低。

MACF1通过激活WNT信号通路促进黏附斑形成

RNA-seq分析和GSEA显示"WNT_SIGNALING_PATHWAY"基因集富集程度最高。核质分离和Western blot发现MACF1敲低后CTNNB1核积累显著减少，免疫荧光显示CTNNB1核定位降低。LEF/TOP荧光素酶报告基因实验表明MACF1缺陷细胞转录活性显著降低，WNT下游基因ZEB1、CD44和FN1 mRNA水平显著下调。TCGA-LUAD队列分析显示MACF1高表达与WNT信号和黏附相关基因表达呈正相关，且患者总生存期和无进展生存期更差。

CTNNB1激动剂恢复MACF1敲低细胞的黏附斑和增殖

使用CTNNB1激动剂TWS119处理MACF1敲低细胞，发现其能诱导CTNNB1核积累，增强细胞增殖和DNA复制能力。黏附斑相关基因Paxillin、FAK和ITGB1表达显著升高，免疫荧光显示膜定位Paxillin增加，明胶黏附实验表明黏附能力改善，Transwell迁移实验显示细胞运动能力显著增强。

MACF1受转录因子NR2F1的转录调控

通过TFBS预测和TRRUST数据库挖掘发现NR2F1是MACF1启动子的关键调控因子。TCGA-LUAD队列Spearman相关分析显示NR2F1与MACF1表达水平呈显著正相关。ChIP-qPCR实验证实NR2F1抗体免疫沉淀复合物中MACF1启动子区域富集，ENCODE数据库ChIP-seq数据显示肺癌细胞中NR2F1全基因组结合信号显著高于正常肺组织，尤其在MACF1转录起始位点。NR2F1敲低实验显著降低MACF1表达。

NR2F1敲低损害LUAD细胞增殖和黏附斑

NR2F1沉默显著抑制肺腺癌细胞增殖和DNA复制能力，降低Paxillin、FAK和ITGB1表达水平。明胶包被板黏附实验显示黏附细胞数量减少，免疫荧光显示Paxillin膜定位降低，细胞迁移能力受损。核质分离和免疫荧光显示CTNNB1核定位显著减少，WNT下游靶基因表达下调。

MACF1过表达恢复NR2F1缺陷LUAD细胞的黏附斑

在NR2F1缺陷细胞中过表达MACF1能显著增加CTNNB1核定位，提升LEF/TOP转录活性和下游靶基因表达。MACF1过表达使黏附斑相关基因表达升高，膜定位Paxillin增加，细胞黏附能力显著改善，并促进NR2F1缺陷细胞的增殖和迁移能力。

本研究系统阐明了MACF1在肺腺癌进展中的功能作用和调控机制，证实MACF1通过激活Wnt/β-连环蛋白信号通路显著增强关键黏附斑组分的表达和膜定位，从而促进细胞黏附、迁移和体内转移潜能。研究发现MACF1转录受核受体转录因子NR2F1直接调控，由此提出NR2F1转录激活MACF1进而增强Wnt信号活性和促进黏附斑形成的功能轴。这一调控级联反应揭示了驱动肺腺癌转移的先前未被认识的机制，为转移性肺癌的治疗干预提供了有希望的候选靶点。

该研究的创新性在于首次将细胞骨架调节因子MACF1与转录调控和信号转导联系起来，确立了其在肺腺癌转移中的核心地位。从临床意义来看，TCGA-LUAD队列分析显示MACF1高表达与不良预后显著相关，且与Wnt和黏附相关基因表达升高相关，强化了其预后和治疗潜力。尽管研究存在免疫缺陷模型无法完全模拟肿瘤免疫微环境等局限性，但NR2F1-MACF1-Wnt轴的发现为理解肺腺癌转移提供了全新视角，为开发针对该信号通路的抗转移疗法奠定了重要理论基础。未来研究可在免疫系统完整的遗传工程肺腺癌模型中验证这一轴心作用，并深入解析MACF1促进β-连环蛋白核转位的精确分子机制，进一步推动其临床转化应用。