Opn3-phiC31o基因敲入小鼠模型验证：非视觉光感受器Opn3的功能性敲除与位点特异性重组系统建立

《Eye and Vision》：Validation of phiC31-mediated expression and functional knockout of Opn3 in the Opn3-phiC31o knock-in mouse

本研究针对非视觉光敏蛋白Opn3功能研究缺乏高效遗传工具的问题，开发了Opn3-phiC31o基因敲入小鼠模型。通过CRISPR-Cas9技术将phiC31o-poly(A)序列插入Opn3翻译起始位点，证实phiC31o mRNA表达模式与内源性Opn3一致，纯合子小鼠表现出与既往报道一致的低温耐受性下降和近视表型。研究同时发现Chml基因转录起始位点位于预测外显子2上游112bp处，确保该模型为单一Opn3敲除。尽管重组效率在 cerebellum为30%-44%，视网膜中较低，但该模型为Opn3表达细胞的形态学研究和多重组系统应用提供了新工具。

　　

在生命科学领域，非视觉光感受器opsin家族的神秘面纱正在被逐步揭开。其中，Opn3（encephalopsin/panopsin）作为最早发现的哺乳动物眼外光感受器，其功能研究却相对滞后。这种蓝光敏感的G蛋白偶联受体不仅在大脑广泛表达，还分布于脂肪组织、皮肤、平滑肌等外周器官，参与体温调节、黑色素生成、平滑肌光松弛等多种生理过程。然而，由于缺乏可靠的特异性抗体，研究人员不得不依赖基因工程小鼠模型来探索Opn3的功能奥秘。

目前存在的Opn3-mCherry敲入小鼠和Opn3-eGFP BAC转基因小鼠虽然为研究提供了重要工具，但科学界仍迫切需要开发更多元化的遗传操作平台。特别是能够与现有Cre/loxP系统并行使用的位点特异性重组系统，将极大促进对多种非视觉光感受器同时表达模式的解析。phiC31整合酶系统因其单向重组特性（attB/attP→attL/attR）而备受关注，但其在Opn3研究中的应用尚未见报道。

更复杂的是，Opn3基因座与Chml（choroideremia-like）基因存在基因组结构上的重叠。根据NCBI注释，两个基因共享第一外显子，这意味着任何针对Opn3第一外显子的基因操作都可能意外破坏Chml功能，导致对实验结果的误读。这种基因组结构的复杂性为Opn3特异性遗传工具的开发带来了额外挑战。

针对这些问题，Keio大学的研究团队在《Eye and Vision》上发表了他们的最新成果。他们成功构建了Opn3-phiC31o基因敲入小鼠模型，并系统验证了该模型在Opn3功能研究和细胞特异性标记中的应用价值。

研究团队采用的主要技术方法包括：利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建Opn3-phiC31o基因敲入小鼠；通过原位杂交（ISH）技术检测Opn3、phiC31o和Chml的mRNA表达模式；使用5'RACE技术确定Chml基因的转录起始位点；通过植入式遥测探头监测小鼠低温暴露下的体温变化；利用光谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）系统进行眼部生物参数测量；将Opn3-phiC31o小鼠与ROSA26 MultiFPsAPuro报告小鼠杂交，通过免疫组化检测phiC31o介导的重组效率。

Generation and validation of Opn3-phiC31o KI mice

研究团队首先利用CRISPR-Cas9系统将phiC31o-poly(A)序列精确插入到Opn3翻译起始位点，成功构建了Opn3-phiC31o基因敲入小鼠模型。

通过原位杂交技术验证发现，杂合子小鼠脑中phiC31o mRNA的表达模式与内源性Opn3 mRNA高度一致，cerebellum中phiC31o表达量达到Opn3的97%，表明phiC31o确实在Opn3启动子控制下表达。更重要的是，纯合子小鼠脑中完全检测不到Opn3信号，证明Opn3基因被成功敲除。

Opn3 was functionally knocked out in our Opn3-phiC31o mice

为验证Opn3的功能性敲除，研究人员重复了既往报道的冷暴露实验。将野生型和Opn3-phiC31o纯合子小鼠置于4°C环境中90分钟，记录体温变化。结果显示，纯合子小鼠体温下降幅度显著大于野生型（P=0.044），与既往Opn3敲除小鼠表型一致。

眼部生物学参数测量进一步证实了表型的可靠性。Opn3-phiC31o纯合子小鼠表现出明显的近视表型，眼轴长度显著缩短，前房深度和晶状体厚度减小，与既往报道的Opn3敲除小鼠近视表型一致。这些结果共同证实了Opn3在纯合子小鼠中被成功功能性敲除。

The Opn3-phiC31o homozygotes did not disrupt Chml gene transcription

研究的一个重要发现是解决了基因组结构复杂性问题。尽管NCBI注释显示Opn3和Chml共享第一外显子，但通过原位杂交和5'RACE分析，研究人员发现Chml的实际转录起始位点位于预测第二外显子上游112bp处。

这意味着Opn3-phiC31o基因敲入实际上不会破坏Chml基因功能，确保了该模型是单一的Opn3敲除模型，而非双基因敲除。这一发现不仅解决了本研究的潜在技术问题，还为相关领域提供了重要的基因组注释修正。

Calculation of the recombination efficiency in mice

研究人员通过将Opn3-phiC31o小鼠与ROSA26 MultiFPsAPuro报告小鼠杂交，评估了phiC31o介导的重组效率。该报告系统在CAG启动子和mCerulean基因间含有attB-多重报告基因-attP盒，phiC31o介导重组后表达mCerulean荧光蛋白。

结果显示，在cerebellum的Purkinje细胞层，杂合子小鼠的重组效率为30.3%±6.36%，纯合子为44.4%±11.8%。mCerulean表达主要出现在olfactory bulb、cerebral cortex、thalamus和cerebellum等脑区，与既往报道的Opn3表达模式基本一致，但信号强度较弱，覆盖范围较窄。

Low recombination efficiency in the retina

视网膜中的重组效率极低，在观察的12个视网膜中（6只小鼠），仅3个视网膜中发现5个mCerulean表达细胞：1个水平细胞（HC）和4个视网膜神经节细胞（RGCs）。

尽管数量有限，但这些稀疏标记的细胞为研究Opn3阳性神经元的完整形态结构提供了独特机会。特别是发现的B型轴突水平细胞，其形态特征与既往描述一致，为Opn3在视网膜水平细胞中的表达提供了初步证据。

研究结论表明，Opn3-phiC31o基因敲入小鼠模型虽然存在重组效率较低的局限性，但作为Opn3无效模型具有重要价值。该模型不仅解决了Chml基因共表达的技术难题，还为Opn3表达细胞的稀疏标记和形态学分析提供了独特工具。特别是当与现有的Opn4-Cre和未来可能开发的Opn5-Dre系统结合时，有望实现多种非视觉光感受器表达模式的同时解析。

讨论部分指出，phiC31o的重组效率确实低于Cre和Dre系统，这一局限性限制了其在全面绘制Opn3表达图谱中的应用。然而，这种稀疏标记的特性反而为单个Opn3阳性神经元的详细形态学分析提供了机会。研究还发现，Opn3在发育过程中表达动态变化，新生儿期RGCs中表达广泛，成年后局限于少数细胞，这解释了视网膜中重组效率低的现象。

该研究的重要意义在于首次建立了Opn3特异的phiC31o重组系统，为非视觉光感受器研究提供了新的遗传工具。同时，对Chml转录起始位点的精确鉴定解决了基因组注释错误可能带来的技术隐患，为相关研究提供了重要参考。尽管存在重组效率限制，但这一模型为理解Opn3在体温调节、视觉发育和光感受机制中的复杂功能开辟了新途径。