碳分解代谢物阻遏元件CrcY/CrcZ调控恶臭假单胞菌KT2440聚羟基脂肪酸酯代谢的机制研究

《Biotechnology for Biofuels and Bioproducts》：The link of carbon catabolite repression elements, small RNAs CrcY and CrcZ and polyhydroxyalkanoate metabolism in Pseudomonas putida KT2440

本研究针对聚羟基脂肪酸酯(PHA)生产成本高、机械性能差等问题，通过过表达碳分解代谢物阻遏(CCR)系统中的小RNA CrcY和CrcZ，显著提升了恶臭假单胞菌KT2440的PHA产量（提高1.3–3.5倍）并调控聚合物分子量。研究揭示了CrcY/CrcZ通过依赖Hfq和Crc蛋白的机制影响β-氧化和转运蛋白表达，为优化mcl-PHA生产提供了新策略，对开发生物可降解塑料具有重要意义。

　　

随着全球塑料污染问题日益严峻，生物可降解材料聚羟基脂肪酸酯(PHA)因其环境友好性备受关注。然而，PHA的大规模应用仍面临两大瓶颈：一是生产成本高昂，二是其机械性能（如脆性或强度不足）和热稳定性较差，难以替代传统石油基塑料。恶臭假单胞菌KT2440作为合成中链长度PHA(mcl-PHA)的模式菌株，可通过调控代谢通路优化PHA产量与性能，但其调控网络尤其碳分解代谢物阻遏(CCR)系统与PHA代谢的关联尚不明确。

为解析CCR关键元件小RNA CrcY和CrcZ如何影响PHA合成，Che等人通过基因工程手段在恶臭假单胞菌KT2440中过表达CrcY和CrcZ，并系统评估了其在葡萄糖（非偏好碳源）和辛酸（PHA相关碳源）条件下的PHA积累、聚合物特性及蛋白组响应。研究发现，过表达任一小RNA均能显著提升PHA产量，尤其在氮限制条件下，辛酸培养基中PHA产量最高增加3.5倍（达63%细胞干重）。有趣的是，PHA分子量（如M_n和M_w）在葡萄糖条件下明显降低，表明CCR调控可同步影响产量与聚合物链长。进一步机制研究表明，CrcY/CrcZ的作用依赖Hfq和Crc蛋白，双缺失菌株（ΔcrcY/ΔcrcZ）PHA合成能力显著下降，而单缺失无明显影响，提示二者功能互补。蛋白组学分析揭示了β-氧化关键酶（如PhaJ4、FadE同源物）和氨基酸代谢酶（GcdH、GGT）的上调，可能通过增强前体供应和氧化应激响应间接促进PHA合成。

关键技术方法

研究采用CRISPR/Cas9系统构建基因缺失菌株，利用pBT'Tmcs质粒进行CrcY/CrcZ的组成型过表达；通过气相色谱(GC)分析PHA含量与单体组成，凝胶渗透色谱(GPC)测定分子量，差示扫描量热法(DSC)评估热性能；结合液相色谱-质谱(LC-MS/MS)进行蛋白组学定量，辅以主成分分析和KEGG通路富集挖掘差异表达蛋白；使用生物反应器进行规模化PHA生产验证。

研究结果

1. CrcY或CrcZ过表达促进PHA积累

在氮限制条件下，过表达菌株pCrcY和pCrcZ的PHA产量较对照提升1.3–3.5倍，且碳源转化效率提高。辛酸作为碳源时效果更显著，表明CCR调控与碳源类型密切相关。

2. PHA聚合物特性变化

过表达菌株合成的PHA单体组成未变，但葡萄糖条件下的分子量（M_w、M_n）显著降低，结晶度下降，而辛酸条件下变化不显著，提示碳源依赖性的链长调控机制。

3. 蛋白组响应揭示代谢重编程

ABC转运蛋白和β-氧化酶（如PhaJ3/4）表达上调，GcdH和GGT的持续高表达暗示其通过氨基酸代谢和氧化应激响应间接支持PHA合成。值得注意的是，直接P合成酶PhaC1表达未受影响，表明调控并非通过直接激活PHA合成途径。

4. CrcY与CrcZ功能互补

双缺失菌株（ΔcrcY/ΔcrcZ）在葡萄糖条件下PHA产量下降60%，而单缺失无显著影响，证实二者在CCR调控中的协同作用。

5. Hfq和Crc蛋白的必要性

在Δhfq或Δcrc背景中过表达CrcY/CrcZ无法提升PHA产量，甚至在Δhfq菌株中抑制PHA积累，表明完整的CCR系统是调控效应的基础。

结论与意义

本研究首次系统阐明了CCR小RNA CrcY和CrcZ通过依赖Hfq/Crc的机制调控恶臭假单胞菌PHA代谢的双重作用：既提升产量，又调控聚合物分子量。这一发现为通过合成生物学手段优化PHA的产量与材料性能提供了新靶点，尤其为开发mcl-PHA作为PHB共混增塑剂提供了理论依据。研究还揭示了CCR调控网络的复杂性，其效应受碳源、营养条件及全局蛋白互作的多重影响，为后续解析细菌碳资源分配机制奠定了坚实基础。论文发表于《Biotechnology for Biofuels and Bioproducts》，为可持续生物塑料产业的升级提供了关键技术支撑。