冠突曲霉在小叶苦丁茶基质中响应NaCl诱导渗透压的代谢重编程与抗氧化机制解析

《BMC Biotechnology》：Metabolic responses and antioxidant mechanisms of Aspergillus cristatus to NaCl-induced osmotic stress in small-leaved Kuding tea media

本研究针对小叶苦丁茶发酵过程中渗透压波动影响冠突曲霉(Aspergillus cristatus)代谢品质的难题，通过建立0%-12% NaCl梯度渗透模型，结合LC-MS非靶向代谢组学与体外抗氧化活性评估，揭示4%-8% NaCl可通过协同激活色氨酸代谢(产生褪黑素)和类黄酮生物合成(生成木犀草素)等核心通路，显著提升菌体抗氧化能力，为高抗氧化功能茶制品开发提供精准调控策略。

　　

在传统茶叶发酵工业中，冠突曲霉(Aspergillus cristatus)作为关键发酵菌种，广泛应用于普洱茶、茯砖茶等特色茶品的生产。这种真菌能够通过代谢茶叶内源成分，生成多酚、氨基酸等功能性物质，赋予发酵茶独特的醇厚口感与陈香风味，同时增强其抗氧化、抗菌等生物活性。然而在实际工业化发酵过程中，环境因素（如pH值、渗透压）常出现剧烈波动，直接影响冠突曲霉的生长状态和代谢途径，最终导致发酵茶品质的不稳定。特别是作为传统代用茶的小叶苦丁茶，虽然富含三萜、黄酮等天然活性成分，但因苦涩味重和性寒特质，市场接受度有限。通过微生物发酵改良其风味和功能特性已成为行业研究热点，而冠突曲霉正是小叶苦丁茶发酵的核心菌株之一。

目前研究多集中于环境因子对冠突曲霉基础代谢的调控机制，例如 Xie 等发现NaCl渗透胁迫能引起代谢物数千倍的变化，Zhang 等报道不同pH环境诱导特异性抗氧化代谢响应。但这些实验室应激模型未能在实际茶叶基质中验证，难以直接指导发酵工艺优化。尤其渗透压变化对冠突曲霉在小叶苦丁茶发酵过程中代谢调控的影响尚属空白。为此，研究团队以NaCl为环境调控因子，在小叶苦丁茶培养基中建立0%、4%、8%、12%四个渗透压梯度，通过形态学观察、体外抗氧化活性检测和液相色谱-质谱联用(LC-MS)非靶向代谢组学分析，系统解析冠突曲霉在不同盐浓度下的代谢响应规律与抗氧化机制。

关键技术方法概述

研究采用小叶苦丁茶培养基（含1.6%琼脂）培养冠突曲霉14天，通过菌落直径测量和形态描述评估生长状况；采用超声水提法制备菌丝体提取液，分别通过ABTS/DPPH自由基清除率、脂质过氧化抑制率和铁离子还原能力(FRAP)四种方法测定体外抗氧化活性；利用UPLC-Orbitrap Exploris 120系统进行LC-MS非靶向代谢组学检测，通过XCMS软件进行峰识别与对齐，采用二级质谱碎片比对HMDB、LIPID MAPS等数据库进行代谢物鉴定（要求前体质量误差<30 ppm，综合评分>0.6）；运用PCA、OPLS-DA等多变量统计分析筛选差异代谢物（标准：FC>2或<0.5，p<0.05，VIP>1），并通过KEGG富集分析揭示关键代谢通路。

菌落形态学观察结果

NaCl浓度显著影响冠突曲霉菌落形态：0% NaCl组菌落近圆形（直径2.52±0.09 cm），呈绒状质地；4%与8% NaCl组菌落直径最大（3.73±0.18 cm、3.22±0.19 cm），呈不规则棉絮状；12% NaCl组菌落最小（1.04±0.09 cm），结构致密。菌落颜色从低盐到高盐由黄褐色向淡黄色渐变，提示不同盐浓度可能激活差异代谢合成途径。

体外抗氧化活性评估

4%与8% NaCl组在ABTS自由基清除率（94.60%、95.18%）、DPPH自由基清除率（45.75%、44.88%）、脂质过氧化抑制率（71.56%、73.27%）和FRAP（20.50 μmol/g、21.18 μmol/g）四项指标上均显著优于0%与12% NaCl组（p<0.0001），表明中盐条件（4%-8%）能最大化激活抗氧化防御系统。

代谢组学差异分析

PCA与OPLS-DA模型显示不同盐浓度组代谢谱显著分离（累积方差解释率62.4%-64.9%）。从780个鉴定代谢物中筛选出556个差异物，其中93个为共有差异代谢物，涵盖氨基酸、有机酸、类黄酮等7大类。

核心代谢通路调控

KEGG富集分析识别出13条显著改变通路，其中色氨酸代谢（路径影响值最高）、类黄酮生物合成、辅因子生物合成等构成核心调控轴。4% NaCl下褪黑素（色氨酸代谢产物）、赤藓糖醇、木犀草素（类黄酮）等关键抗氧化剂显著积累。

代谢物-抗氧化活性关联

相关性分析揭示22种代谢物（如褪黑素、赤藓糖醇）与四种抗氧化指标均呈正相关。根据盐响应特征，代谢物可分为四类：持续累积型（如茉莉酸甲酯）、阈值激活型（如富马酸）、盐抑制型（如黄原素）和中盐优化型（如木犀草素）。

讨论与结论

研究首次在实际茶叶发酵体系中揭示冠突曲霉通过动态重构代谢网络适应渗透压变化的机制：低盐（0% NaCl）条件下类黄酮通路上调促进黄原素积累，但色氨酸代谢抑制导致广谱抗氧化能力不足；中盐（4% NaCl）通过多通路协同激活，实现渗透调节（赤藓糖醇）与抗氧化防御（褪黑素、木犀草素）的双重优化；高盐（12% NaCl）则抑制核心通路，转向茉莉酸甲酯等特异性修复代谢物积累。

该发现为精准发酵技术提供理论依据：通过CRISPR编辑限速酶定向强化褪黑素合成途径，结合AI辅助质谱监控，可开发高值功能茶产品。研究发表于《BMC Biotechnology》，为小叶苦丁茶等高抗氧化功能茶制品的工艺升级与代谢工程改造提供创新思路。