复合芽孢杆菌制剂通过多通路协同抑制苹果腐烂病的机制与应用研究

《Annals of Microbiology》：Compound Bacillus agents inhibit Cytospora mali-induced valsa canker in Hanfu apple trees through multiple pathways

本研究针对苹果腐烂病(Cytospora mali引起的Valsa canker)这一严重威胁寒富苹果生产的真菌病害，开发了一种由三株芽孢杆菌(Bsu181、Bli279和Bam190)组成的复合生防制剂。研究发现该制剂通过直接抑制病原菌生长(抑制率达75.56-97.78%)、提高宿主抗氧化酶活性(POD:1505.7-2036.48 U/g·min; PPO:163.51-201.52 U/g·min)、上调防御基因PR1(4.70倍)表达、促进气孔开放(0.414μm)和光合作用，以及重塑根际微生物群落(增加有益菌Chaetomium、Mortierella、Sphingomonas，减少病原菌Penicillium、Cladophialophora)等多重协同机制，实现对病害的74.8-81.9%防控效果，同时促进树木生长。该研究为苹果腐烂病的绿色防控提供了创新性解决方案，对推动可持续苹果生产具有重要意义。

　　

在东北地区广泛种植的寒富苹果因其优良风味和抗寒性备受青睐，然而一种名为苹果腐烂病的真菌病害正悄然蔓延，成为制约苹果产业发展的隐形杀手。这种由Cytospora mali(Cma)病原菌引起的病害，会导致树枝腐烂、树势衰弱，严重时甚至造成整株死亡，给果农带来巨大经济损失。当前主要依赖化学杀菌剂的防治手段不仅存在环境污染风险，还可能诱发病原菌抗药性。面对这一困境，开发环境友好型的生物防治替代方案迫在眉睫。

在这项发表于《Annals of Microbiology》的研究中，沈阳农业大学刘志华团队另辟蹊径，将目光投向了新疆野生果林土壤中的天然微生物资源。研究人员设想，自然界中是否存在能够有效抑制Cma的微生物？这些微生物能否通过多种协同机制实现对苹果腐烂病的综合防控？为解答这些问题，研究团队开展了一系列系统性研究。

研究主要采用了以下关键技术方法：从新疆野生果林10种植物根际土壤中分离筛选芽孢杆菌；通过对峙培养、发酵滤液抑制试验和菌丝形态观察评估抗菌活性；测定防御酶(POD、PPO)活性和MDA含量；采用qPCR分析防御基因(PR1、PR4、PR10)表达；开展田间试验评估病害防控效果和促生作用；利用Illumina NovaSeq平台进行16S rRNA和ITS测序分析微生物群落变化。

芽孢杆菌的分离与鉴定

研究人员从新疆野生果林10种不同植物的根际土壤中成功分离出123株芽孢杆菌，通过形态学观察初步分为15种类型。分子生物学鉴定显示这些菌株属于8个不同的芽孢杆菌种，其中从胡杨(Populus euphratica)、新疆野苹果(Malus pumila)等植物根际分离的菌株多样性最为丰富。这一发现证实了新疆野生果林土壤中蕴藏着丰富的芽孢杆菌资源，为后续功能菌株筛选奠定了基础。

优势生防芽孢杆菌的筛选

通过系统的功能评价，研究团队筛选出三株具有卓越生防潜力的菌株：Bacillus subtilis Bsu181、Bacillus licheniformis Bli279和Bacillus amyloliquefaciens Bam190。对峙培养试验显示，这三株菌对Cma的抑制率分别达到75.56%、80.00%和97.78%。进一步研究发现，其发酵滤液能引起Cma菌丝变形、皱缩，并导致菌丝细胞膜通透性增加，相对电导率显著升高。生理生化特性分析表明，这些菌株还具有固氮、溶磷、分泌IAA(吲哚乙酸)、蛋白酶和植酸酶等多种促生功能，综合评分均达到"Class I"等级。

三株芽孢杆菌对寒富苹果腐烂病的生防效果

在离体枝条试验中，三株芽孢杆菌及其复合制剂(Tcom)均能有效抑制Cma的扩展。其中Bam190单菌处理和三菌复合处理效果最佳，病害扩散程度分别降至18.1%和25.2%。机理研究表明，芽孢杆菌处理能显著激活寒富苹果的防御系统：POD(过氧化物酶)活性在处理12天时达到2036.48 U/g·min，为对照的3.4倍；PPO(多酚氧化酶)活性也显著提高至201.52 U/g·min。同时，MDA(丙二醛)含量维持在较低水平(16.25-24.70μmol/L)，表明氧化损伤得到有效缓解。qPCR分析发现，Bsu181和Tcom处理能分别上调PR1基因表达3.63倍和4.70倍，PR4基因也有明显诱导，表明系统抗性被成功激活。

复合芽孢杆菌制剂促进寒富苹果树生长特性

田间试验结果显示，复合芽孢杆菌制剂不仅能有效控制病害(病情指数降至25.0±0.8)，还能显著促进树木生长。处理组苹果树枝叶数量更多，叶片长度、宽度、厚度和鲜重均显著增加。特别值得注意的是，处理组叶片气孔开度达到0.414μm，显著大于对照组的0.183μm，这种气孔行为的改善有助于增强光合作用和物质运输能力。地下部生长也得到促进，根系干重和侧根数量明显增加，根际土壤pH从弱碱性(7.53)调整为更适宜植物生长的微酸性(6.41)。

复合芽孢杆菌制剂促进根系生长和根际土壤微生物富集

微生物群落分析揭示了复合芽孢杆菌制剂对根际微生态的重塑作用。真菌群落分析发现，处理组土壤中新增967个真菌物种，有益真菌如Mortierella(被孢霉)和Chaetomium(毛壳菌)的相对丰度显著增加，而病原真菌Cladophialophora和Penicillium(青霉)的丰度明显降低。细菌群落方面，处理组特有2489个细菌物种，Sphingomonas(鞘氨醇单胞菌)、Serratia(沙雷氏菌)等有益菌群显著富集。功能预测分析表明，处理组土壤中与碳代谢和硝化作用相关的细菌功能增强，而与光自养相关的功能减弱，这种功能转变有利于土壤健康和植物营养吸收。

研究结论表明，这种由三株芽孢杆菌精心配制的复合制剂，通过直接抑制病原菌、诱导植物系统抗性、促进树木生长和调控根际微生物群落的多重协同机制，实现了对苹果腐烂病的有效防控。与传统的单一作用机制的生防制剂相比，这种多通路协同的作用模式不仅防控效果更为持久稳定，还能同时促进树木健康生长，真正实现了"防病"与"促生"的双重目标。

该研究的创新之处在于首次系统阐明了芽孢杆菌复合制剂通过多通路协同作用防控苹果腐烂病的分子机制和生态机制，为开发高效稳定的微生物农药提供了理论依据和实践模板。相比化学农药，这种生物防治策略更具环境友好性和可持续性，符合绿色农业发展需求。未来，通过优化菌株组合、完善制剂工艺和探索与其他农业措施的集成应用，这种复合芽孢杆菌制剂有望成为苹果腐烂病综合管理的重要技术支撑，为苹果产业的可持续发展提供有力保障。