AcrEF外排泵通过破坏宿主紧密连接调控鼠伤寒沙门氏菌侵袭力的关键作用

《Biology Direct》：Indispensable role of AcrEF in modulating Salmonella virulence and disrupting host tight junctions to facilitate paracellular entry and invasion

本研究针对沙门氏菌侵袭上皮细胞的分子机制不明确的问题，通过构建cpxR和acrEF基因缺失突变株，系统评估了AcrEF外排泵在沙门氏菌侵袭过程中的功能。研究发现AcrEF通过调控SPI-1毒力基因表达和破坏宿主细胞紧密连接（包括ZO-1、occludin和claudin等蛋白）促进细菌侵袭，且该作用独立于CpxR调控。该研究为开发针对多重耐药沙门氏菌的新型治疗策略提供了重要靶点。

　　

沙门氏菌感染一直是全球性的公共卫生挑战，其中鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium, ST）作为非伤寒沙门氏菌的重要代表，不仅引起自限性胃肠炎，还可导致危及生命的血流感染和中枢神经系统感染。特别值得关注的是，随着多重耐药菌株的不断出现，沙门氏菌感染的临床治疗变得愈发困难。在这一背景下，深入理解沙门氏菌致病机制，寻找新的治疗靶点显得尤为重要。

沙门氏菌的成功感染依赖于其精确感知宿主环境并调控毒力基因表达的能力。CpxA-CpxR双组分系统作为重要的包膜应激反应调节系统，在沙门氏菌应对环境压力中发挥关键作用。然而，CpxR如何通过调控下游靶基因影响沙门氏菌侵袭上皮细胞的分子机制尚不完全清楚。Kirthika等人在《Biology Direct》发表的研究正是针对这一科学问题展开，他们通过差异基因表达分析发现，药物外排泵AcrEF可能是CpxR调控沙门氏菌侵袭力的关键中介。

为阐明AcrEF在沙门氏菌侵袭过程中的具体作用机制，研究人员采用了一系列关键技术方法：通过RNA测序进行差异基因表达分析；利用λ-Red同源重组技术构建基因缺失突变株；采用体外细胞感染模型（包括bEND.3、Caco-2和Neuro2A细胞系）评估细菌黏附、侵袭能力；通过转录组分析和qRT-PCR检测毒力基因表达；使用跨上皮电阻测量和透射电镜观察紧密连接完整性；建立小鼠感染模型评估体内定植能力；并运用计算机模拟和细菌双杂交实验分析蛋白质相互作用。

基因表达谱分析揭示acrEF的调控特征

研究人员首先通过RNA测序比较野生型ST（JOL 401）和cpxR缺失突变株（JOL 910）的基因表达谱。结果显示，在cpxR缺失背景下，acrEF/envCD操纵子转录调节因子表达显著上调。更为重要的是，在感染上皮细胞条件下，acrE和acrF的表达在cpxR突变株中分别上调超过4倍，而外膜通道蛋白tolC的表达也增加了6倍，表明在感染过程中CpxR可能抑制acrEF-tolC外排系统的表达。

AcrEF缺失显著增强抗生素敏感性

通过药敏试验评估AcrEF在外排泵功能中的作用发现，acrEF单缺失突变株（JOL 2539）和cpxR/acrEF双缺失突变株（JOL 2555）对β-内酰胺类（氨曲南、阿莫西林、头孢他啶、头孢唑林）和四环素类（多西环素、四环素）抗生素的敏感性显著增加，而cpxR单缺失对药敏性影响不大。这表明AcrEF在介导沙门氏菌多重耐药性中起关键作用，且这一功能独立于CpxR调控。

AcrEF是上皮细胞侵袭的必要因子

细胞侵袭实验显示，acrEF缺失突变株在bEND.3和Caco-2细胞中的黏附和侵袭能力严重受损，而在Neuro2A细胞中仍保留部分侵袭能力，表明沙门氏菌可能采用不同的侵袭机制应对不同类型的上皮细胞。值得注意的是，cpxR单缺失对侵袭能力影响不大，而acrEF缺失则几乎完全 abolished细菌侵袭能力，且回补实验可恢复侵袭表型，证实AcrEF在沙门氏菌侵袭过程中的核心作用。

AcrEF调控SPI-1毒力基因表达

进一步机制研究发现，acrEF缺失突变株在感染bEND.3细胞时，SPI-1关键调节基因hilD和invF以及下游效应因子sipA和sopB的表达显著降低。同时，外膜蛋白OmpA的表达也受到影响，这可能是突变株黏附能力下降的原因之一。这些结果表明AcrEF通过调控SPI-1毒力岛基因表达影响沙门氏菌的侵袭能力。

AcrEF缺失减弱宿主炎症反应

感染实验显示，野生型菌株能诱导bEND.3细胞产生强烈的炎症反应，TNF-α、IL-1β、IL-8和IFN-γ等炎性细胞因子表达显著上调。相比之下，acrEF突变株诱导的炎症反应微弱。此外，野生型感染还显著上调宿主凋亡相关因子ENOPH1、ADI1和Caspase-3的表达，而突变株的促凋亡效应明显减弱，表明AcrEF参与调控沙门氏菌诱导的宿主炎症和细胞死亡途径。

AcrEF破坏宿主紧密连接完整性

研究团队通过检测紧密连接相关基因表达发现，acrEF突变株感染的细胞中ZO-1、ZO-2、ZO-3、occludin和claudin家族蛋白表达水平显著高于野生型感染组。跨上皮电阻测量结果显示，野生型感染导致上皮屏障功能严重破坏，而acrEF突变株对上皮完整性的影响较小。透射电镜观察直接证实野生型菌株能引起紧密连接结构明显扩张，而突变株感染组的紧密连接结构与未感染组相似。

AcrEF与紧密连接蛋白存在直接相互作用

计算机模拟和细菌双杂交实验表明，AcrE和AcrF蛋白能与宿主紧密连接蛋白ZO-1的PDZ结构域直接结合，结合能分别为-702.4 kcal/mol和-1060.0 kcal/mol。这一发现提示AcrEF可能通过直接干扰紧密连接蛋白复合物的稳定性促进上皮屏障破坏。

AcrEF缺失减弱体内致病性

小鼠感染实验证实，acrEF突变株在脑组织中的定植能力完全丧失，脾脏定植也显著减少。组织病理学分析显示野生型感染引起脑组织严重中性粒细胞浸润和出血性病变，而acrEF突变株感染组未见明显病理改变。免疫荧光检测进一步证实野生型菌株能在脑组织中有效定位，而突变株则无法突破血脑屏障。

靶向AcrEF的干预策略展示治疗潜力

研究人员制备了抗AcrE和AcrF的多克隆抗体，发现抗体处理能显著抑制野生型沙门氏菌对bEND.3细胞的侵袭。更重要的是，感染后给予抗体治疗能有效减少细菌在脑组织中的定植，表明靶向AcrEF可能成为控制沙门氏菌感染的新策略。

本研究系统阐明了AcrEF外排泵在沙门氏菌侵袭过程中的核心作用：不仅通过调控SPI-1毒力基因表达影响细菌侵袭能力，还通过直接破坏宿主紧密连接促进上皮屏障穿透。值得注意的是，AcrEF的功能虽然部分受CpxR调控，但其在介导沙门氏菌侵袭中的作用独立于CpxR通路。这些发现不仅深化了对沙门氏菌致病机制的理解，更重要的是为开发针对多重耐药沙门氏菌的新型治疗策略提供了潜在靶点。靶向AcrEF的干预措施可能有效抑制沙门氏菌的侵袭能力，同时逆转其耐药表型，具有重要的临床转化价值。