四倍体马铃薯昼夜转录组揭示节律基因表达与序列保守性及其在驯化中的意义

《BMC Genomics》：High resolution diel transcriptomes of autotetraploid potato reveal expression and sequence conservation among rhythmic genes

本研究针对高度杂合的四倍体马铃薯，通过高分辨率昼夜转录组分析，揭示了节律性等位基因在表达强度和序列保守性上的显著特征。研究人员发现节律性等位基因表达更高、跨组织共表达更强，且非同义/同义置换比率更低，表明其核心功能更保守。研究进一步鉴定了光周期依赖的核糖体生物合成和病原响应基因相位变化的关键调控因子，并对现代栽培马铃薯长日照下块茎形成的调控机制提出了新见解。该研究为理解植物节律表达在人工选择和无性繁殖过程中的保守性提供了重要资源。

　　

植物如何感知并响应昼夜与季节的变化，是一个古老而迷人的科学问题。对于马铃薯（Solanum tuberosum）这类通过块茎进行无性繁殖的重要作物而言，光周期（日照长短）更是直接决定了其能否顺利结薯，从而影响产量。现代栽培马铃薯是一种高度杂合的同源四倍体（autotetraploid）植物，其基因组包含四套相似的染色体。由于长期依赖克隆繁殖，其基因组中积累了大量的有害等位基因，这使得四倍体马铃薯成为研究人工选择和克隆繁殖过程中基因表达，特别是具有昼夜节律（diel rhythms）的基因表达如何演化和保守的理想模型系统。然而，由于此前缺乏单倍型分辨率（haplotype-resolved）的基因组数据，科学家们难以精确区分四倍体中四个不同等位基因（alleles）的表达差异，从而无法深入探究节律性表达在等位基因层面的保守性与多样性。

为了解决这一难题，由Eva M. Farré和C. Robin Buell共同领导的研究团队在《BMC Genomics》上发表了他们的最新成果。他们以栽培马铃薯品种“Atlantic”为研究对象，分别在长日照（LD, 16小时光照/8小时黑暗）和短日照（SD, 12小时光照/12小时黑暗）条件下，以2小时为间隔，高分辨率地采集了叶片和块茎组织的样本，并利用“Atlantic”单倍型分型的基因组参考序列进行了RNA测序（RNA-Seq）分析。这项研究不仅提供了高质量的马铃薯昼夜转录组数据集，更深入揭示了节律性等位基因在表达水平、序列进化以及功能上的独特性质。

为开展本研究，研究人员主要应用了以下几项关键技术：首先，利用GENESPACE软件进行基因组共线性（synteny）分析，以准确鉴定跨单倍型的同源等位基因群（syntenic allelic groups）。其次，通过JTK-CYCLE算法对标准化后的基因表达量进行节律性分析，严格筛选具有显著昼夜振荡模式的转录本。再者，利用马铃薯发育基因表达图谱（Developmental Gene Expression Atlas）进行基因表达广度（Tau指数）和等位基因间表达相关性（Pearson相关）分析。此外，还通过SynMap计算等位基因对的非同义置换率（Kn）与同义置换率（Ks）的比值（Kn/Ks）以评估选择压力，并采用Mercator4进行功能富集分析（functional enrichment）和HOMER进行顺式作用元件（cis-element） motif富集分析。

完全节律性等位基因群表现出更强的节律性和更高的表达水平

研究人员首先鉴定了23,733个高置信度的同源等位基因群。通过节律性分析发现，在叶片中，约有33.6%的表达转录本在SD或LD条件下呈现显著节律性（JTK p值 < 0.001），而在块茎中，这一比例仅为1.1%（图1A, B）。一个关键发现是，大多数具有多个等位基因的节律性基因处于“混合节律性”（mixed rhythmicity）状态，即并非所有等位基因都同步振荡（图1C）。然而，属于节律性基因的等位基因，其本身也更可能具有节律性（图1D）。更重要的是，那些所有等位基因均同步振荡的“完全节律性”（full rhythmicity）基因，其节律强度（由JTK p值衡量）显著高于“混合节律性”基因中的节律性等位基因（图2A）。功能富集分析显示，完全节律性基因显著富集于光合作用光反应和核糖体生物合成（ribosome biogenesis）等核心功能通路（图2B）。此外，节律性转录本的整体表达水平显著高于非节律性转录本（图2C），并且其表达更具组成型（constitutive），组织特异性较低（图2D）。这些结果表明，节律性mRNA水平对于执行植物核心生命活动的基因尤为重要。

节律性等位基因在不同组织和胁迫条件下均表现出高度共表达

尽管存在“混合节律性”现象，但大多数完全节律性的等位基因对（allelic pairs）之间的表达相位差小于2小时（图3A），并且其标准化后的表达曲线呈现出极高的相关性（超过80%的基因对相关性 > 0.85）（图3B）。这种高度的表达协同性不仅存在于昼夜周期中，还延伸至不同的组织、发育阶段和胁迫条件下。与不完全节律或非节律的等位基因对相比，完全节律性等位基因对在组织和胁迫数据集中依然保持着最强的共表达（图3C）。进一步支持这一保守性的是进化分析：完全节律性等位基因对的Kn/Ks比值显著低于非节律性对（图3D），表明它们受到更强的纯化选择（purifying selection），功能上更为保守。

叶片与块茎组织间以及不同光周期下表达相位的显著变化

高时间分辨率的数据使得精确比较不同组织间的表达相位成为可能。研究发现，在短日照条件下，叶片中节律性基因的表达峰值遍布全天，而块茎中的峰值则主要集中在光照期（图4A, C）。对于在叶片和块茎中均呈节律性的521个转录本，近一半（47%）在块茎中的表达相位相比叶片延迟了至少2小时，平均延迟达4.4小时（图4D）。利用GH3::LUC生物发光报告基因的实验证实，当块茎处于黑暗环境中时，即使存在温度周期，其节律相位也会相对于叶片发生延迟（图4E），这表明光信号对于直接协调块茎的生物钟至关重要。

研究还发现，光周期对基因表达有深远影响。与长日照相比，短日照条件下有更多节律性转录本的表达量上调（图5A），且振荡幅度（amplitude）更大（图5B）。更重要的是，约51%在两个光周期下均节律表达的基因，在长日照下的相位发生了延迟（平均延迟3.7小时）（图5C）。其中，716个基因的相位延迟达到或超过6小时，这些基因显著富集于核糖体生物合成、病原响应（pathogen responses）、WRKY转录因子活性等功能类别（图5D）。核糖体生物合成相关基因的mRNA在短日照下于黎明前后达到峰值，而在长日照下则推迟到傍晚（图5E）。研究人员推测，端粒结合蛋白（Telomere Binding Protein, TRB）可能参与了这一光周期依赖的相位调控，因为在相位延迟显著的核糖体基因启动子区富集了TRB结合 motif（图5F）。类似地，相位强烈延迟的病原响应基因则富集了WRKY转录因子结合 motif（图5G），提示特定的WRKY因子（如StWRKY30, StWRKY38, StWRKY63）可能调控了这些基因的时序表达。

生物钟、光周期和块茎形成相关基因的表达特征

研究人员特别关注了496个与生物钟（circadian clock）、光周期感知和块茎形成（tuberization）相关的基因（CPT基因）。分析显示，核心生物钟和光周期相关基因的节律性比例和完全节律性比例均高于基因组平均水平（图6A, B），且多个核心时钟组件（如RVE3/5, LHY, PRR5等）在所有等位基因上均表现出稳健的协同振荡（图6C）。对于块茎形成通路，研究发现在能长日照结薯的“Atlantic”品种中，尽管含有截短型CDF1等位基因（推测能稳定存在并抑制CO表达），但CO1和CO2基因仍表现出光周期依赖的相位变化（图7）。同时，SP5G（CO的靶基因）在长日照叶片中表达上调，而块茎形成诱导因子SP6A在短日照下表达显著更高，但在长日照下仍可检测到表达。此外，另一个块茎形成正调控因子BEL5在短日照下表达也有上调。这些结果表明，在现代栽培马铃薯中，可能存在除CDF1-CO-SP5G轴之外的、更复杂的调控机制来实现长日照下的块茎形成。

综上所述，这项研究通过对同源四倍体马铃薯进行等高分辨率等位基因特异性昼夜转录组分析，揭示了节律性表达在植物基因功能中的核心地位。研究表明，节律性等位基因不仅在不同环境条件下保持高度的表达协同性，而且在序列和功能上受到更强的进化约束，提示昼夜节律是核心管家功能（core housekeeping functions）的一个重要特征。研究还阐明了光周期对核糖体生物合成和免疫响应基因表达相位的深刻影响，并为其调控机制提供了线索。最后，对块茎形成调控通路基因的分析为理解马铃薯如何适应不同光周期环境提供了新的视角。该研究产生的高质量数据集和深入分析，为未来马铃薯乃至其他多倍体作物的生长发育改良和抗逆性研究奠定了坚实的基础。