中国奶牛乳腺炎源ST103血清型Ia无乳链球菌的表型与基因型特征及其致病性研究

《BMC Microbiology》：Phenotypic and genotypic characterization of ST103 serotype Ia Streptococcus agalactiae isolated from bovine mastitis in China

本研究针对中国奶牛群中爆发的无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）乳腺炎，通过全基因组测序（WGS）、表型分析及全基因组关联分析（GWAS），系统解析了ST103血清型Ia菌株的种群结构、耐药性及致病性。研究发现菌株携带tetO、ermB等耐药基因与表型耐药相关，并通过体外乳腺上皮细胞（bMECs）模型和大蜡螟（Galleria mellonella）模型揭示了菌株黏附、侵袭及毒力差异。泛基因组分析显示核心基因组保守，附属基因组贡献遗传多样性，为针对性防控策略提供了新靶点。

　　

奶牛乳腺炎是全球乳业面临的最普遍且棘手的疾病之一，而无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）作为一种典型的传染性病原体，是导致该病的重要原因，给畜牧业造成巨大的经济损失。近年来，尽管在发达国家通过实施“五点计划”等防控措施，无乳链球菌的流行在一定程度上得到了控制，但在中国等地的奶牛群中，其分离率却呈现上升趋势，可高达18.6%，成为一个新的防控挑战。然而，对于中国奶牛群中流行的无乳链球菌，其种群结构、分子特征、致病性以及耐药性谱系仍不清晰，这限制了我们制定精准有效的防控策略。为了解决这些问题，Wang等研究人员在《BMC Microbiology》上发表了他们的最新研究成果。

为了回答上述问题，研究团队开展了一项系统性的工作。他们从2020年9月至2021年4月期间，在中国宁夏和河北省三个发生乳腺炎疫情的规模化奶牛场中，共采集了266份奶样（其中235份来自临床性乳腺炎，31份来自亚临床性乳腺炎）。通过细菌学培养、革兰氏染色、CAMP试验和16S rRNA测序，最终鉴定出116株无乳链球菌。随后，他们采用分层随机抽样的方法，从这三个牛场中选取了27株具有代表性的菌株（其中4株来自A场，11株来自B场，12株来自C场）进行深入的表型和基因型分析。

本研究运用的关键技术方法主要包括：通过16S rRNA测序和多位点序列分型（MLST）进行菌种鉴定和种群结构分析；利用Illumina NovaSeq 6000平台进行全基因组测序（WGS）及后续的基因组组装、注释；通过最小抑菌浓度（MIC）测定进行抗菌药物敏感性试验；采用体外牛乳腺上皮细胞（bMECs）模型评估细菌的细胞毒性（通过LDH释放检测）、黏附和侵袭能力；利用大蜡螟（Galleria mellonella）幼虫感染模型进行体内毒力评价；运用全基因组关联分析（GWAS）寻找与毒力表型相关的基因；并进行了泛基因组分析以了解菌株的基因组多样性。样本来源于中国三个大型奶牛场（>2000头奶牛）的乳腺炎爆发事件。

菌株基本特征与种群结构

所有116株无乳链球菌经血清分型和MLST分析，均被鉴定为血清型Ia和序列型ST103。这表明在所研究的中国奶牛群中，引起乳腺炎爆发的无乳链球菌具有高度保守的克隆背景。ST103是一种在牛和人中均有报道的常见序列型，提示其可能存在跨宿主传播的潜力。

抗菌药物耐药性（AMR）谱

对27株代表性菌株进行了13种抗菌药物的MIC测定。所有菌株均对替米考星耐药，对土霉素和四环素的耐药率分别高达74.07%和55.56%，对万古霉素的耐药率为33.33%。所有菌株对头孢噻呋、青霉素G、阿莫西林和林可酰胺类敏感。基因型分析显示，所有菌株均携带mprF基因。C场菌株携带tetO基因，A场菌株携带tetM基因，这与它们对四环素类药物的表型耐药高度一致。此外，4株来自C场的菌株（C04, C05, C35, C50）同时携带ermB和tetO基因，表现出对多种大环内酯类（阿奇霉素、泰乐菌素、替米考星）和四环素类药物的多重耐药。这些结果强调了抗菌药物滥用可能驱动耐药性的发展，并提示需谨慎使用相关药物。

致病性评价

通过体外bMECs模型和体内大蜡螟模型评估了菌株的致病性。结果显示，来自C场的菌株刺激bMECs释放乳酸脱氢酶（LDH）的量、对细胞的黏附率和侵袭率均显著高于B场菌株。

相应地，感染C场菌株的大蜡螟幼虫存活率也显著低于其他组。这些结果表明，不同来源的ST103 Ia型菌株在毒力上存在显著差异，C场菌株表现出更强的致病性。

毒力基因与基因组特征

通过对27株菌进行全基因组测序，共鉴定出34个推测的毒力基因，这些基因功能涉及黏附（如fbs54, fbsB）、免疫逃逸（如cps基因簇）、毒素（如cyl操纵子基因、cfa/cfb）、蛋白酶等。所有菌株均属于II-A型CRISPR-Cas系统。值得注意的是，仅在B场菌株的基因组中预测到了前噬菌体区域，这提示了不同地理来源菌株的遗传多样性。

全基因组关联分析（GWAS）

GWAS分析揭示了与毒力、黏附、侵袭以及大蜡螟死亡率显著相关的基因。共鉴定出166个与毒力相关基因，221个与黏附相关基因，218个与侵袭相关基因，以及47个与大蜡螟感染致病性相关的基因。

这些基因功能多样，例如bin3（推测的转座酶）、soj（染色体分离ATP酶ParA）、adhA2（乙醇脱氢酶）以及介导耐药的aadK（氨基糖苷腺苷转移酶）和tetO（四环素耐药基因）等。这为了解无乳链球菌的致病机制和发现新的药物靶点提供了重要线索。

泛基因组分析

研究还将这27株菌与NCBI数据库中的1394株无乳链球菌基因组进行了泛基因组分析。结果显示，1421个菌株共包含20,955个基因，其中核心基因组（所有菌株共有）包含666个基因，附属基因组（非所有菌株共有）包含20,289个基因。

基于核心基因构建的系统发育树显示，同一牛场内的菌株基因组高度同源，且C场菌株与A场菌株亲缘关系更近，而与B场菌株较远。

功能注释表明，核心基因主要与信息存储、加工和代谢相关，而附属基因和独特基因则更多地与代谢功能相关。

本研究首次对中国奶牛群乳腺炎爆发事件中的ST103血清型Ia无乳链球菌进行了综合性的表型和基因型特征解析。研究不仅确认了该克隆在中国地区的流行，更重要的是，揭示了不同农场菌株在毒力和耐药性上存在的显著差异，并将这些表型与特定的基因型（如毒力基因谱、AMR基因）关联起来。通过GWAS分析，预测了大量可能与致病性相关的新基因靶点。泛基因组分析则从宏观层面展示了该物种的遗传多样性。这些发现深化了我们对无乳链球菌致病机制和耐药性传播的理解，为未来开发新的治疗策略（如针对特定毒力因子或耐药机制）、制定基于分子分型的精准监测方案以及评估跨宿主传播风险提供了重要的科学依据，对有效控制由无乳链球菌引起的奶牛乳腺炎具有重要意义。