质粒pHXY0908通过调控外排泵基因表达介导鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14,028环丙沙星异质性耐药机制解析

《BMC Microbiology》：Plasmid pHXY0908 confers ciprofloxacin heteroresistance to Salmonella enterica serovar typhimurium ATCC 14028 by regulating efflux pump gene expression

本研究针对鼠伤寒沙门氏菌中由质粒pHXY0908介导的环丙沙星异质性耐药现象，通过全基因组测序（WGS）、转录组分析（RNA-seq）和染色体空间构象解析（Hi-C）等技术，揭示其耐药性由外排泵AcrAB-TolC的转录调控驱动，并发现新型转录抑制因子STM14_2687。该质粒可跨物种传播耐药性，为临床应对多重耐药菌感染提供新靶点和预警策略。

　　

在抗生素耐药性日益严峻的全球公共卫生挑战中，异质性耐药（heteroresistance）作为一种隐蔽的耐药机制，已成为导致感染复发和治疗失败的关键因素。鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）作为重要的食源性病原体，其耐药性问题尤为突出。尽管氟喹诺酮类药物如环丙沙星（ciprofloxacin）曾是其有效治疗手段，但耐药菌株的涌现使得临床治疗陷入僵局。更棘手的是，异质性耐药现象——即同一菌群中存在少量高耐药亚群——使得标准药敏试验难以准确预警治疗风险，亟需深入解析其分子机制。

在此背景下，Li等人发表于《BMC Microbiology》的研究聚焦于质粒pHXY0908如何介导鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14,028对环丙沙星的异质性耐药。该团队通过多组学联用策略，首次揭示质粒通过重塑染色体三维结构调控外排泵基因表达，并鉴定出关键转录抑制因子STM14_2687，为理解异质性耐药演化路径提供了全新视角。

本研究的关键技术方法包括：通过群体分析图谱（population analysis profiling, PAP）和抗生素药敏试验确认异质性耐药表型；利用全基因组测序（WGS）和转录组测序（RNA-seq）分析耐药亚群的基因组变异和转录调控特征；采用加权基因共表达网络分析（WGCNA）筛选与耐药表型相关的基因模块；通过染色体构象捕获（Hi-C）技术解析质粒介入对染色体空间结构的影响；最后通过基因过表达和RT-qPCR验证关键调控因子功能。

确认鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14,028-pHXY0908的环丙沙星异质性耐药

研究通过群体分析实验证实，携带质粒pHXY0908的菌株中有0.026%和0.002%的亚群分别能在0.5 μg/mL和1 μg/mL环丙沙星浓度下存活。从不同浓度抗生素平板中随机选取的亚克隆其MIC值提升至母株的2~8倍，且该表型在无抗生素传代后保持稳定，符合异质性耐药特征。

异质性耐药亚克隆中DNA突变稀少

全基因组测序显示，MIC升高的亚克隆仅携带2~12个单核苷酸变异（SNV），且均未出现在已知的环丙沙星耐药相关基因（如gyrA、parC等）。所有耐药亚克隆共享一个位于STM14_1424（RecE蛋白编码基因）的移码突变，但其与耐药性的直接关联尚不明确，表明基因组突变并非异质性耐药的主因。

转录组谱揭示异质性耐药的调控异质性

转录组分析发现，亚克隆间基因表达存在显著异质性。趋势聚类将基因分为5类，其中Cluster 1（含acrA、acrB、tolC）的表达水平与MIC值呈正相关，而Cluster 3（含oqxA、oqxB）则呈先升后降趋势，提示AcrAB-TolC外排泵而非OqxAB是主要耐药贡献者。

WGCNA鉴定MIC相关模块及关键基因

通过WGCNA分析筛选出与MIC显著相关的“棕色模块”，其168个基因富集于氧化还原过程、膜蛋白复合体等通路。该模块中acrA、acrB、tolC具有高基因显著性（GS）和模块成员性（MM），同时发现sodB（超氧化物歧化酶）、dps（DNA保护蛋白）、STM14_2687（预测为LysR型转录因子）等潜在耐药相关基因。

STM14_2687作为acrAB-tolC转录抑制因子的功能验证

基因表达相关性分析显示STM14_2687与acrA、acrB、tolC表达呈显著负相关。过表达STM14_2687可抑制acrAB-tolC转录，并使环丙沙星MIC下降2倍，证实其作为外排泵负调控因子的功能。

质粒介入引起染色体空间结构重构

Hi-C分析发现，携带pHXY0908后菌株的染色体互作域（CID）从15个减少至12个，且44%的耐药相关基因（包括acrAB-tolC）位于CID边界区域，提示质粒通过改变染色体三维结构间接影响基因表达。

pHXY0908介导跨物种异质性耐药

将质粒转入其他肠杆菌科标准菌株（如大肠杆菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC 700603）后，均出现环丙沙星异质性耐药，表明pHXY0908具有跨物种传播风险。

结论与讨论

本研究系统阐明了质粒pHXY0908通过转录调控驱动鼠伤寒沙门氏菌环丙沙星异质性耐药的多层次机制：一方面，质粒介入引起染色体空间重构，间接激活外排泵AcrAB-TolC等耐药相关基因表达；另一方面，鉴定出新型转录抑制因子STM14_2687，其过表达可逆转耐药表型。该研究突破传统耐药突变研究框架，揭示质粒-染色体互作在异质性耐药演化中的核心作用，为临床监测质粒传播风险提供了分子标志物，同时提示STM14_2687可作为潜在药物靶点用于逆转化疗耐药性。