纤毛蛋白空间互作的原位邻近连接检测技术及其在纤毛病研究中的应用

《BMC Molecular and Cell Biology》：In situ proximity ligation assay for analysing spatial interactions between ciliary proteins

本研究针对纤毛过渡区蛋白互作空间信息缺失的技术瓶颈，开发了基于原位邻近连接检测（in situ PLA）的高分辨率定位方案。通过优化抗体选择、酶促反应条件及成像流程，成功实现了Rpgrip1l与Psmd2/Rpgrip1在纤毛基部的近距离互作可视化，为纤毛病分子机制研究提供了关键方法学支持。该技术填补了传统互作检测技术与亚细胞定位间的空白，对揭示纤毛相关疾病病理具有重要意义。

　　

在细胞生物学领域，纤毛（cilia）作为一种微小的细胞器，长期被视为细胞的“天线”，负责接收外界信号并调控关键生理过程。然而，当纤毛的结构或功能出现异常时，会引发一系列被称为“纤毛病”（ciliopathies）的遗传性疾病。这类疾病可能影响多个器官系统，包括肾脏、视网膜和大脑发育等，其背后机制与纤毛过渡区（transition zone）的蛋白互作网络紊乱密切相关。

过渡区位于纤毛基部，作为“守门人”严格控制蛋白质的进出，但其分子组成和相互作用的空间细节仍不清楚。传统技术如酵母双杂交（Y2H）或免疫共沉淀（Co-IP）虽能鉴定蛋白互作，却无法揭示互作发生的具体亚细胞位置；而邻近标记技术（如BioID、TurboID）虽能动态捕获互作蛋白，但缺乏空间分辨率。这一技术空白限制了人们对纤毛病机制的理解。

为解决这一问题，Pfirrmann等人在《BMC Molecular and Cell Biology》发表的研究中，系统优化了原位邻近连接检测（in situ PLA）技术，并将其应用于纤毛蛋白互作的空间分析。该技术通过抗体识别靶蛋白，经DNA探针杂交、连接成环、滚动环扩增（RCA）及荧光信号检测，可实现40纳米范围内的蛋白互作可视化。

关键技术方法

研究以小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）为模型，通过血清饥饿诱导纤毛形成，并转染IFT88-EYFP融合蛋白标记纤毛结构。实验采用针对Rpgrip1l和Psmd2/Rpgrip1的特异性抗体，经封闭、探针杂交、连接酶与聚合酶分步反应后，通过荧光显微镜检测信号。所有动物实验均符合德国海因里希·海涅大学伦理规范（许可号O18/99）。

研究结果

1. 蛋白互作的空间验证

通过in situ PLA技术，研究团队首次在野生型MEFs中观察到Rpgrip1l与蛋白酶体组分Psmd2在纤毛基部的近距离互作信号（红色荧光点），证实两者在过渡区形成功能复合物，提示Rpgrip1l可能通过直接互作调控纤毛蛋白酶体活性。

2. 疾病相关突变体的互作缺陷

在Rpgrip1^{nmf247/nmf247}突变型MEFs中（表达截短型Rpgrip1蛋白），in situ PLA未检测到Rpgrip1l与突变蛋白的互作信号，表明该突变破坏了过渡区蛋白复合物的组装，这可能是导致纤毛功能障碍的直接原因。

3. 技术特异性验证

通过阴性对照实验（仅使用单一抗体），研究证实in situ PLA信号严格依赖于双靶标抗体的同时存在，排除了非特异性背景干扰，凸显了技术的高可靠性。

结论与意义

本研究通过优化in situ PLA技术，实现了对纤毛过渡区蛋白互作的高精度空间解析。结果表明，Rpgrip1l与Psmd2的互作位于纤毛基部，且疾病相关突变会破坏这一互作网络。该技术不仅弥补了传统互作检测方法的空间信息缺失问题，还为纤毛病的分子诊断提供了新思路。未来，通过结合多种荧光标记策略（如抗体-染料偶联物），in situ PLA有望进一步拓展至多组分互作分析，推动纤毛生物学研究向更高分辨率迈进。