单细胞与孟德尔随机化联合分析揭示食管癌免疫新辅助治疗疗效差异的潜在机制

《Hormones & Cancer》：Integrated single-cell and Mendelian randomization analyses: dissecting underlying causes of varied efficacy in immune neoadjuvant therapy for esophageal carcinoma

本研究针对食管鳞状细胞癌(ESCC)免疫新辅助治疗疗效差异的临床难题，通过整合单细胞RNA测序(scRNA-seq)与孟德尔随机化(MR)分析，系统解析了肿瘤微环境中CD4+T细胞的动态变化及其关键调控基因PLTP的作用机制。研究发现CD4+T细胞亚群比例与治疗反应显著相关，并通过MR鉴定出PLTP作为ESCC风险的关键因果基因。该研究为ESCC免疫治疗疗效预测提供了新的生物标志物和精准医疗策略。

　　

在全球范围内，食管癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率分别位居全球第七和第六位。尤其令人担忧的是，食管癌患者的五年生存率仅为15%-25%，预后极差。在中国，食管鳞状细胞癌(ESCC)占所有食管癌病例的90%以上，成为严重的公共卫生问题。

传统上，局部晚期ESCC的标准治疗方案包括根治性手术以及以顺铂+5-氟尿嘧啶为基础的新辅助化疗。然而，随着免疫治疗时代的到来，KEYNOTE-590、CHECKMATE-648和ESCORT-1st等关键临床试验证实了化疗联合免疫检查点抑制剂作为一线治疗晚期ESCC的有效性，推动了免疫治疗在新辅助治疗中的应用探索。KEYSTONE-002和PALACE-1研究报告显示，免疫联合放化疗新辅助治疗局部晚期ESCC的病理完全缓解(pCR)率分别达到56%和46.1%，而NICE研究使用卡瑞利珠单抗联合白蛋白紫杉醇和卡铂的方案也获得了45.4%的pCR率。

尽管免疫新辅助治疗显著提高了ESCC的治疗效果，但仍有相当比例的患者未能从中获益。传统的生物标志物如肿瘤突变负荷(TMB)、微卫星不稳定性和PD-L1蛋白表达在预测免疫治疗疗效方面存在局限性。KEYNOTE-590和CHECKMATE-648研究均证实免疫治疗的疗效与PD-L1状态无关。因此，开发能够准确预测ESCC免疫治疗疗效的新型生物标志物成为临床实践的迫切需求。

肿瘤异质性是ESCC的重要特征，表现为染色体拷贝数变异、细胞标志物差异表达以及不同肿瘤进展阶段细胞功能差异等。近年来，单细胞测序技术的发展为深入理解肿瘤异质性提供了有力工具。scRNA-seq、单核RNA测序(snRNA)、TCR测序、空间转录组学和全基因组测序等技术能够从基因组学、转录模式和肿瘤微环境(TME)等多个层面全面解析肿瘤发展过程。

与此同时，孟德尔随机化(MR)分析作为一种新兴的因果推断方法，利用遗传变异作为工具变量，模拟随机对照试验的设计，评估暴露因素与健康结局之间的因果关系。MR研究已经揭示了多种因素与肿瘤发生发展的关联，为肿瘤病因学研究提供了新视角。

本研究创新性地将scRNA-seq与MR分析相结合，旨在揭示ESCC免疫新辅助治疗疗效差异的潜在机制。研究人员通过对三个公共数据库(GSE203115、GSE221561和OMIX005710)中16个样本的scRNA-seq数据进行整合分析，共获得40,198个基因和120,102个细胞的单细胞图谱。根据治疗反应，将患者分为"反应/刺激组"(完全缓解CR或主要病理缓解MPR)和"无反应/对照组"(不完全病理缓解IPR)。

研究人员采用了一系列先进的技术方法开展本研究。首先，利用Seurat R软件包(v5.2.1)对scRNA-seq数据进行质量控制、标准化和整合，应用Harmony算法消除批次效应，通过UMAP进行细胞聚类可视化。其次，采用差异表达分析(Wilcoxon秩和检验)、基因集富集分析(GSEA)、基因集变异分析(GSVA)以及细胞通讯分析(CellChat)等方法深入解析细胞功能状态。此外，还进行了伪时间轨迹分析(Monocle 2)和基因调控网络分析(pySCENIC)以探索细胞发育动态和转录调控机制。在MR分析方面，研究人员从BBJ-a-117、EBI-a-GCST90018621和EBI-a-GCST90018841三个GWAS队列获取数据，采用逆方差加权(IVW)、MR-Egger回归等多种方法评估基因表达与ESCC风险的因果关系。

3.1 免疫新辅助治疗效果与ESCC免疫细胞的关系特征

研究人员通过对16个单细胞样本的分析，成功构建了ESCC免疫细胞的全面图谱。经过质量控制和数据整合后，共获得40,198个基因和120,102个单细胞。通过降维聚类和双联体过滤，细胞被分为16个簇，进一步注释为上皮细胞、成纤维细胞、淋巴细胞和髓系细胞四大谱系。值得注意的是，不同组织样本中这些细胞类型的比例和数量存在显著差异，暗示这些差异可能与免疫新辅助治疗的疗效相关。

3.2 不同疗效ESCC组织中淋巴细胞的差异和功能

通过分离淋巴细胞并进行二次聚类分析，研究人员将34个细胞簇分为六大主要细胞类型。比较"反应/刺激组"和"无反应/对照组"发现，两组间淋巴细胞比例存在显著差异。差异表达基因(DEGs)的GO分析显示这些基因与"免疫应答激活"等功能相关，GSEA分析揭示了与IL6_JAK_STAT3信号传导、血管生成等通路的显著关联。细胞通讯分析显示，虽然两组内部均存在密集的细胞通讯网络，但"无反应/对照组"的通讯强度(699次)明显高于"反应/刺激组"(560次)。

3.3 不同疗效ESCC组织中免疫细胞类型和数量的差异

为了更精确地分析免疫细胞，研究人员对PTPRC阳性的免疫细胞进行了进一步筛选，最终获得35,479个基因和37,296个免疫细胞。经过聚类分析，这些细胞被分为8个亚群。虽然两组均包含所有免疫细胞亚型，但各亚型的数量在不同患者间存在显著差异。特别值得注意的是，"无反应/对照组"具有更多的CD8⁺T细胞，而"反应/刺激组"则表现出更多的CD4⁺T细胞和肥大细胞。

3.4 不同预后ESCC组织中免疫细胞的功能差异

研究人员在两组间共鉴定出2,573个显著差异表达基因(DEGs)。GO分析显示这些基因与免疫应答激活相关，而GSEA分析则发现它们与血管生成、凝血等信号通路有关。GSVA分析显示两组间通路活性存在显著差异，表明疗效差异可能与免疫细胞功能状态相关。细胞通讯分析进一步证实，"无反应/对照组"的细胞通讯数量(546次)明显多于"反应/刺激组"(402次)。与CD4表达密切相关的基因如IL-2、CD2、CD7等均与免疫功能相关。伪时间分析显示，"反应/刺激组"的CD4⁺T细胞更多地参与了细胞进化过程。

3.5 不同疗效ESCC组织中T细胞亚群类型和数量的差异

鉴于前期分析提示CD4⁺T细胞是免疫新辅助治疗效果差异的主要贡献者，研究人员进一步分离了"CD4⁺T"、"CD8⁺T"、"增殖细胞"和"T细胞"亚群进行分析。所有T细胞亚群均表达LAG3、CTLA4、CD274等免疫治疗标志物，但表达谱存在差异。重要的是，"反应/刺激组"具有更多的CD4⁺T细胞，而"无反应/对照组"则表现出更多的CD8⁺T细胞。

3.6 不同预后ESCC组织中T细胞的功能差异

在T细胞亚群中，研究人员共鉴定出3,311个显著差异表达基因。GO分析显示这些基因与免疫应答激活相关，KEGG分析提示它们与细胞因子通路相关。GSEA分析揭示了与血管生成、凝血、IL6-JAK-STAT3和NOTCH信号通路等的关联。GSVA分析显示两组间通路活性存在差异，特别是这些变化主要集中在CD4⁺T细胞中。细胞通讯分析显示，"无反应/对照组"的通讯数量(850次)明显多于"反应/刺激组"(580次)。与CD4相关的基因如IL-32、CD2、CD7等与免疫分子相关。上皮间质转化(EMT)评分在"反应/刺激组"中更高。

3.7 不同预后ESCC组织中CD4⁺T细胞亚群类型和数量的差异

研究人员进一步提取了"CD4⁺T"、"TH17"和"Treg"亚群进行深入分析。所有CD4⁺T细胞亚群均表达经典免疫标志物，但表达谱存在差异。特别值得注意的是，"反应/刺激组"中Treg细胞显著增加，而"无反应/对照组"中Tfh_BCL6细胞明显增多。

3.8 不同预后ESCC组织中CD4⁺T细胞亚群的功能差异

在CD4⁺T细胞亚群中，研究人员鉴定出748个显著差异表达基因。GO分析显示这些基因与适应性免疫应答相关，KEGG分析提示它们与细胞因子通路相关。GSEA分析发现了与干扰素α反应、KRAS信号、TGFβ信号和干扰素γ反应等通路的关联。这些变化主要集中在Tfh_BCL6(上调)和Treg(下调)亚群中。细胞通讯分析显示，"反应/刺激组"的细胞通讯数量(222次)多于"无反应/对照组"(152次)。与CD4表达相关的基因如IL-32、CD27、HLA-A/B等与免疫分子相关。EMT评分在两组间存在显著差异。

3.9 通过孟德尔随机化研究探讨PLTP基因在食管癌中的作用

通过比较淋巴细胞、免疫细胞、T细胞和CD4⁺T细胞亚群中差异表达基因的重叠，研究人员鉴定出95个共同差异表达基因。利用MR分析，他们发现PLTP和PKD4是与ESCC风险显著相关的共享基因。PLTP在T细胞亚群和CD4⁺T细胞亚群中广泛表达，且在"反应/刺激组"中表达更高，特别是在CD4⁺T细胞及其Treg亚群中。SCENIC分析鉴定出BCL3、E2F1等关键转录因子。与PLTP表达相关的基因主要与代谢过程相关，Reactome通路分析显示这些基因与"细胞周期检查点"等通路相关。

本研究通过整合scRNA-seq和eQTL分析，深入探讨了ESCC免疫治疗疗效差异的机制。研究发现CD4⁺T细胞在ESCC免疫微环境中扮演关键角色，与良好的免疫治疗反应相关。通过GWAS数据，研究人员鉴定出PLTP作为食管癌风险基因，在T细胞亚群特别是CD4⁺T细胞中高表达。PLTP作为一个癌基因，不仅影响肿瘤发展，还参与免疫治疗疗效的调节。因此，PLTP和CD4⁺T细胞有望成为预测ESCC免疫治疗反应的生物标志物。

这项研究的重要意义在于首次将单细胞测序与孟德尔随机化分析相结合，系统解析了ESCC免疫微环境的复杂性。研究发现不仅确认了CD4⁺T细胞在免疫治疗中的核心地位，还鉴定出PLTP这一新的关键调控基因。这些发现为开发ESCC精准医疗策略提供了重要理论基础，有望改善患者的临床结局。

然而，本研究也存在一定局限性。单细胞数据缺乏大规模验证，并非所有细胞都表现出特征性基因表达，MR分析仅能提示疾病发生风险而非治疗结局，研究结果仍需进一步的体外和体内实验验证。尽管如此，本研究揭示了ESCC中免疫细胞、遗传因素和治疗反应之间复杂的相互作用，为未来个性化治疗策略的制定提供了重要指导。

总之，该研究强调了scRNA-seq和MR分析在阐明CD4⁺T细胞预测ESCC免疫治疗疗效中的重要性，为个体化治疗开辟了新途径。PLTP作为ESCC关键基因的鉴定为精准医疗提供了新策略，有望在不同疾病阶段改善患者预后。这些发现为预测免疫治疗疗效提供了新视角，但需要更大样本量和实验验证来确认这些发现并充分探索CD4⁺T细胞的潜力。这些努力将推动个性化肿瘤学发展并优化ESCC治疗方案。