乳腺癌微环境中脂肪细胞来源的IL-6通过STAT3/miR-497a-5p信号轴调控PD-L1表达的机制研究

《Journal of Cancer Research and Clinical Oncology》：CAA-derived IL-6 promoted the PD-L1 expression of breast cancer via STAT3/miR-497a-5p signaling

本研究针对乳腺癌微环境中癌症相关脂肪细胞(CAA)如何调控免疫抑制的关键科学问题，通过多组学技术揭示了CAA来源的IL-6通过STAT3/miR-497a-5p信号通路上调PD-L1表达的新机制。研究人员发现CAAs通过分泌IL-6激活STAT3信号，抑制miR-497a-5p表达，从而解除其对PD-L1的靶向抑制作用，最终导致CD8+T细胞功能受损和Tregs细胞增多，为乳腺癌免疫治疗提供了新的靶点策略。

　　

在女性恶性肿瘤中，乳腺癌始终保持着发病率和死亡率双高的严峻态势。尽管诊疗技术不断进步，但肿瘤早期复发和远处转移仍是导致治疗失败的主要原因。近年来，肿瘤微环境(TME)的研究为理解肿瘤恶性进展提供了新视角，其中脂肪细胞作为乳腺癌基质中的重要成分，其与肿瘤细胞的相互作用逐渐受到关注。

当乳腺癌细胞突破基底膜后，会与邻近的脂肪细胞直接接触，这些被"驯化"的脂肪细胞即癌症相关脂肪细胞(CAAs)。与正常脂肪细胞相比，CAAs表现出独特的去分化特征：细胞体积变小、脂滴分散，呈现成纤维细胞样形态，并高表达多种炎症因子。更值得注意的是，CAAs通过分泌多种脂肪因子，不仅促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，还能调控肿瘤免疫微环境，形成有利于肿瘤生长的"土壤"。

然而，CAAs如何精确调控免疫检查点分子PD-L1的表达，进而影响抗肿瘤免疫应答的具体机制尚不清楚。特别是CAAs分泌的IL-6在这一过程中扮演何种角色，以及其下游信号通路如何运作，都是值得深入探讨的科学问题。

为解决这些问题，赵崇如、周小梅等研究人员在《Journal of Cancer Research and Clinical Oncology》上发表了最新研究成果。他们综合利用临床标本分析、细胞共培养模型、动物实验和多组学技术，系统揭示了CAAs通过IL-6/STAT3/miR-497a-5p信号轴调控PD-L1表达的分子机制，为乳腺癌免疫治疗提供了新的理论依据和治疗靶点。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：通过免疫组织化学染色分析临床乳腺癌标本中CAAs的分布特征；利用transwell共培养系统建立CAAs模型；通过CCK-8、划痕实验和transwell实验评估细胞恶性行为；构建小鼠肿瘤模型研究体内肿瘤生长和肺转移；采用流式细胞术分析肿瘤浸润淋巴细胞；通过miRNA测序筛选差异表达miRNA；利用双荧光素酶报告基因验证靶向关系。

CAAs exhibited a de-differentiated phenotype

通过对11例人乳腺癌标本的H&E染色分析，研究人员发现CAAs主要分布在肿瘤侵袭前沿，包括肿瘤周边CAAs和肿瘤内CAAs。与正常乳腺脂肪细胞相比，CAAs直径显著减小。在体外实验中，通过3T3-L1前脂肪细胞成脂分化获得成熟脂肪细胞，再与4T1细胞共培养3天获得CAAs。结果显示CAAs形态发生明显改变：体积变小、形态拉长类似成纤维细胞，脂滴变小且分散。qRT-PCR检测发现，与成熟脂肪细胞相比，CAAs中成熟脂肪细胞标志物C/EBP-α、PPAR-γ和Adipoq表达显著降低，而前脂肪细胞标志物HSL和α-SMA以及促炎因子IL-6表达显著升高，证实了CAAs的去分化特征。

CAAs enhanced the malignant behaviors of 4T1 cells

研究人员通过收集CAAs条件培养基(CAA-CM)和脂肪细胞条件培养基(AD-CM)，研究其对4T1细胞恶性行为的影响。CCK-8实验显示CAA-CM显著促进4T1细胞增殖。划痕实验和transwell迁移实验表明CAA-CM显著增强4T1细胞迁移能力，且效果优于AD-CM。侵袭实验显示类似趋势，CAA-CM有效促进4T1细胞侵袭能力。Western blotting检测上皮-间质转化(EMT)相关蛋白发现，CAA-CM处理组中间质细胞标志物Vimentin蛋白表达显著上调，而上皮细胞标志物E-cadherin表达显著下降，表明CAAs可诱导4T1细胞发生EMT。

CAAs promoted the growth and metastasis of 4T1 cells in vivo

通过建立小鼠皮下荷瘤模型和肺转移模型，研究人员在体内验证了CAAs对4T1细胞的影响。与单独注射4T1细胞的对照组相比，共同注射脂肪细胞和4T1细胞的CAAs组显著促进肿瘤体积增长和肿瘤重量。免疫组化结果显示CAAs组细胞增殖标志物Ki67和内皮细胞标志物CD31表达更高，表明肿瘤增殖能力更强、血管生成更丰富。E-cadherin表达降低而Vimentin表达增强，证实EMT过程发生。在肺转移模型中，经CAA-CM预处理的4T1细胞显著增加肺转移结节数量，表明CAAs促进乳腺癌肺转移。

CAAs enhanced immunosuppression in BC TME in vivo

研究人员从小鼠乳腺肿瘤中提取肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)，通过流式细胞术分析CAAs对肿瘤免疫微环境的影响。结果显示，与对照组相比，CAAs组CD8⁺T细胞比例、IFN-γ⁺CD8⁺T细胞和GzmB⁺CD8⁺T细胞比例显著降低。相反，CAAs组CD4⁺T细胞和FOXP3⁺CD4⁺T细胞比例显著升高。免疫荧光结果进一步证实CAAs组CD8⁺T细胞数量减少、PD-1⁺CD8⁺T细胞增多，CD4⁺T细胞和FOXP3⁺CD4⁺T细胞数量增加。这些结果表明CAAs通过降低细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)比例、增加调节性T细胞(Tregs)比例，创造有利于肿瘤进展的免疫抑制微环境。

CAAs up-regulated PD-L1 expression of 4T1 cells

为进一步证实CAAs对PD-L1表达的调控作用，研究人员检测了临床标本、异种移植瘤和细胞系中PD-L1表达。在人乳腺癌标本中，肿瘤侵袭前沿PD-L1表达明显高于中心区域。同时，侵袭前沿脂肪细胞来源的IL-6表达也高于正常乳腺脂肪组织。Western blotting证实CAAs组异种移植瘤中PD-L1和IL-6表达显著升高。体外实验显示，用不同比例CAA-CM处理4T1细胞，50%CAA-CM显著增加PD-L1表达，表明CAAs可能通过分泌某些细胞因子促进肿瘤细胞PD-L1上调。

CAA-derived IL-6 promoted PD-L1 expression in 4T1 cells through activating STAT3 signaling

ELISA检测显示CAAs组荷瘤小鼠血清IL-6浓度更高，细胞水平上CAA-CM中IL-6含量也高于AD-CM和对照组。Western blotting发现CAA-CM处理的4T1细胞中PD-L1和p-STAT3/STAT3蛋白水平显著升高。中和IL-6后，PD-L1和p-STAT3/STAT3蛋白表达被显著抑制。使用STAT3抑制剂stattic干扰STAT3表达，发现PD-L1表达下降。siRNA敲低STAT3也得到类似结果，证实CAAs通过IL-6/STAT3信号通路上调4T1细胞PD-L1表达。

CAAs down-regulated miR-497a-5p expression in 4T1 cells

通过miRNA测序，研究人员发现CAA-CM处理的4T1细胞中有16个miRNA表达显著改变，其中13个下调、3个上调。值得注意的是，miR-497a-5p在CAAs组异种移植瘤中表达显著降低。体外实验中，CAA-CM处理的4T1细胞miR-497a-5p表达也显著低于对照组和AD-CM组，表明CAAs可下调4T1细胞中miR-497a-5p表达。

CAAs up-regulated PD-L1 expression in 4T1 cells via IL-6/STAT3/miR-497a-5p signaling

qRT-PCR结果显示，IL-6阻断显著减弱了CAAs对4T1细胞miR-497a-5p表达的抑制作用。STAT3敲低后，miR-497a-5p表达显著升高，表明CAAs通过IL-6/STAT3信号负调控miR-497a-5p表达。Western blotting显示STAT3敲低导致PD-L1表达降低，而miR-497a-5p抑制剂可减弱这种抑制效应。双荧光素酶报告基因实验证实PD-L1是miR-497a-5p的直接靶标，当293T和4T1细胞转染野生型质粒和miR-497a-5p抑制剂时，荧光素酶活性显著增加，而突变结合位点后此效应消失。

本研究首次系统揭示了CAAs通过IL-6/STAT3/miR-497a-5p信号轴调控PD-L1表达的新机制。研究发现不仅证实了CAAs在乳腺癌进展中的重要作用，更重要的是阐明了脂肪细胞与肿瘤细胞相互作用调控免疫检查点的具体分子通路。这一发现为理解肿瘤微环境中基质细胞与免疫细胞的复杂交互提供了新视角，也为乳腺癌免疫治疗提供了潜在的新靶点。

从临床转化角度，该研究提示靶向CAAs或其分泌的IL-6可能成为增强免疫检查点抑制剂疗效的新策略。特别是在肥胖相关乳腺癌中，这一通路可能更为活跃，为个体化免疫治疗提供了理论依据。此外，miR-497a-5p作为PD-L1的直接调控因子，其表达水平可能成为预测免疫治疗疗效的生物标志物。

然而，该研究仍存在一些局限性。例如，CAAs影响PD-L1表达可能还存在其他平行信号通路；miR-497a-5p是否还调控其他免疫相关分子尚未明确；临床样本量相对较小，需要更大规模的队列验证这些发现的临床意义。

未来研究可进一步探索CAAs与其他免疫细胞（如巨噬细胞、NK细胞）的相互作用，以及这一通路在不同乳腺癌分子分型中的特异性。同时，开发针对CAAs-肿瘤细胞相互作用的小分子抑制剂或抗体药物，可能为乳腺癌治疗开辟新的途径。

总之，这项研究深化了我们对肿瘤微环境中脂肪细胞与免疫系统相互作用的理解，为开发联合靶向肿瘤细胞和基质细胞的创新治疗策略奠定了重要基础。随着对肿瘤微环境认识的不断深入，针对CAAs及其信号通路的干预措施有望成为乳腺癌综合治疗的新组成部分。