综述：心房颤动的基因治疗

《Journal of Cardiovascular Translational Research》：Gene Therapies in Atrial Fibrillation

本综述系统总结了心房颤动（AF）基因治疗的最新进展，重点探讨了病毒/非病毒载体、心房特异性递送策略及靶向离子通道（如IK,Ach）、纤维化（TGF-β通路）和氧化应激（NOX2、CaMKII）等关键分子机制的治疗潜力。尽管临床前研究显示出逆转电重构和结构重构的突破性成果，但靶向特异性、免疫原性和持久性表达仍是临床转化的核心挑战。

　　

心肌基因转移

基因治疗心房颤动的核心是将遗传物质精准递送至心房心肌组织，以调控疾病的分子机制。目前尚无通用递送方案，需综合考量载体选择、启动子特异性、免疫原性控制及毒性平衡。遗传构建体与载体的兼容性以及心房细胞的高效摄取是关键因素。

遗传构建体需由启动子调控以实现组织特异性表达。心脏特异性启动子如心肌肌钙蛋白T（cTNT）和α肌球蛋白重链（αMHC），以及心房特异性启动子如心房钠尿肽（ANP）已展现出潜力。研究表明，携带ANP启动子的腺相关病毒（AAV）经全身注射后，可在小鼠心房实现剂量依赖性的GFP表达，且在剂量高达5×10¹²基因组拷贝时，心室或心外组织均无检测到信号。

小干扰RNA（siRNA）作为短链双链非编码RNA，可通过RNA诱导沉默复合体（RISC）降解互补mRNA，从而抑制基因表达。近期一项临床前研究使用siRNA靶向STK38L，在转化生长因子β1（TGF-β1）刺激的小鼠心脏成纤维细胞中，使促纤维化标志物POSTN和COL1A1表达降低30%，并显著抑制成纤维细胞增殖和迁移。

短发夹RNA（shRNA）通过RNA干扰（RNAi）通路发挥作用，但以茎环结构从DNA载体细胞内转录，可实现稳定长效的基因沉默并减少脱靶效应。shRNA介导的骨形态发生蛋白2（BMP2）敲低可上调NLRP3炎症小体及IL-1β、IL-6分泌，从而促进促纤维化、促炎症表型，加剧心房纤维化和AF病理过程。

微RNA（miRNA）作为天然非编码RNA，通过结合mRNA的3'非翻译区调控基因表达。靶向miRNA调控在AF临床前研究中显示出潜力，包括减少纤维化和病理性电重构。例如，在暴露于快速起搏HL-1心房肌细胞培养基的人心房成纤维细胞中，抑制miR-21可显著降低活化成纤维细胞标志物α平滑肌肌动蛋白和结缔组织生长因子。

反义寡核苷酸（ASOs）可通过结合互补mRNA序列，经RNase H介导降解、空间阻断翻译或调控剪接来影响蛋白表达。在大鼠模型中，ASO抑制SK3离子通道使SK3蛋白表达下调48%，电 burst刺激诱发的AF发作持续时间减少78%，自发AF事件数量降低68%。

基因编辑工具如CRISPR/Cas9为直接修饰AF相关基因提供可能。早期研究利用其探索转录调控因子对电重构和AF易感性的影响。碱基编辑和先导编辑等新技术以更高精度和更低脱靶效应日益受到关注。

非病毒载体

裸质粒作为环状DNA构建体，可携带比病毒载体更大的转基因且不引发免疫反应。其低摄取率可通过电穿孔技术改善，该技术利用电脉冲打开细胞膜孔道，在AF动物模型中使心房对裸质粒的摄取提高15-20倍。

脂质纳米颗粒（LNPs）作为生物相容性良好的可规模化载体，在遗传物质递送中展现出潜力。基于LNP的疗法Patisiran在转甲状腺素蛋白淀粉样变性中的获批凸显了其治疗价值。在AF领域，mRNA负载的LNPs可能靶向纤维化等通路。在高血压小鼠模型中，CD5靶向的LNPs编码成纤维细胞活化蛋白靶向嵌合抗原受体（CAR） mRNA，可在体内生成瞬时CAR T细胞，从而标准化心脏功能包括左心室舒张末期和收缩末期容积以及射血分数。优化后的可电离LNPs在体外转染效率超过80%，体内心脏组织表达量翻倍。

细胞外囊泡如外泌体，能以低免疫原性转运遗传物质。其在心脏再生领域已有研究。目前，科学家已探究心房和心外膜脂肪来源外泌体对纤维化的贡献。脂肪来源间充质干细胞外泌体富含miR-320d，可通过下调STAT3抑制快速电刺激心肌细胞的凋亡并增强细胞活力。

聚合物、脂质和纳米材料也在心脏基因递送中被研究。

病毒载体

病毒载体利用病毒天然递送遗传物质至宿主细胞的能力，在基因治疗研究中广泛应用。

腺病毒（Ad）作为双链DNA病毒，在体内心脏转导效率达30-50%。在猪模型中，Ad降低了术后AF风险。其基因表达呈瞬时性，通常持续两周。在新西兰白兔中，心外膜递送Ad-KCNH2-G628S可实现长达42天的心房表达，且对心脏功能、血清IL-6或心电图参数无不良影响，证实了腺病毒基因表达的长效性和安全性。

腺相关病毒（AAVs）源自腺病毒，现已成为临床基因治疗中最广泛使用的载体，心脏转导效率达80%及以上。衣壳工程学能够改变病毒趋向性以靶向特定细胞类型。尽管在非心脏用途中取得早期成功，AAVs曾导致致命的肝脏和全身毒性。AAV9在AF中的早期临床前应用涉及在纯合功能缺失大鼠模型中进行肌球蛋白轻链4（Myl4）基因替代。新生大鼠静脉注射野生型Myl4的AAV9恢复了心房MYL4蛋白水平，挽救了包括P波缺失在内的心电图异常，显著改善左心房扩张（舒张直径从6.62 mm降至5.48 mm），恢复左心室射血分数（LVEF），降低炎症细胞因子并减轻心房纤维化。

慢病毒载体（LVs）作为单链RNA逆转录病毒，具有稳定的基因表达、中等携带容量，以及通常20-40%的体内转导效率。虽然LVs可转导分裂后心肌细胞，但其会整合入宿主基因组，存在插入突变风险。该风险阻碍了LV疗法在临床试验中的应用，但临床前研究仍在进行。一项研究中，LVs用于过表达在AF中下调的微RNA，成功恢复大鼠心脏功能并减轻心房重构。另一研究中，慢病毒载体将靶向长链非编码RNA心肌梗死相关转录本的shRNA直接递送至大鼠心房，导致心房有效不应期（AERP）显著增加、AF持续时间缩短，以及心肌纤维化标志物包括胶原蛋白I、胶原蛋白III、CTGF和TGF-β1表达显著降低。

心肌基因递送

静脉（IV）注射将基因疗法直接注入血流，虽属微创技术，但会造成疗法全身分布并被非靶器官吸收。例如，AAV疗法可在肝脏积聚，导致毒性及潜在脱靶效应。

心脏灌注利用冠状血管系统实现局部基因疗法递送，避免侵入性手术通路。通常通过顺行冠状动脉或逆行冠状窦注射，有时联合使用。该技术涉及阻塞血管并使疗法滞留灌注邻近组织。顺行注射已用于心脏基因治疗，但受限于快速冲刷和缺血风险，而冠状窦阻塞可提高转导率。机械循环支持可能进一步增强疗效。逆行冠状窦注射可实现更长效、安全的阻塞，并在心室基因转导中显示成功，但心房递送在顺行与逆行路径间的系统比较尚未进行。

心外膜基因涂抹是一种外科方法，将基因转移载体直接应用于心外膜表面。该技术利用泊洛沙姆/胰蛋白酶化合物延长载体滞留时间和靶位点透壁渗透。其优势在于基因疗法可直接作用于心脏，从而最小化脱靶效应。局限性在于需要手术 access 心外膜表面。在AF中，该技术在多项动物研究中显示疗效。心外膜基因涂抹连接蛋白（Cx40或Cx43）的腺病毒载体在猪模型中显著改善传导速度，降低心房颤动诱导性，并在快速心房起搏一周后较未治疗动物提高窦性心律概率2-4倍。

直接心肌注射通过将基因疗法直接注入靶位点优化局部递送，同时最小化脱靶效应。该技术已成功应用于AF的临床前研究，靶向多种机制包括氧化应激和纤维化。其挑战在于需要直接 access 心脏、心房壁厚度以及注射疗法的有限扩散（其停留在注射部位附近），使得全心房递送在临床环境中效率低下。

心房颤动基因治疗靶点

AF涉及心房心肌的电重构和结构重构，形成折返电路并维持心律失常。对其分子通路理解的深入使得靶向结构、电学和氧化机制的基因治疗策略成为可能。

结构重构

纤维化是AF发病机制中已明确的贡献者。TGF-β信号是关键介质。通过不同通路网络，TGF-β1信号促进心房心肌胶原沉积。靶向TGF-β1信号的基因疗法在犬类模型中显著减少纤维化；具体而言，质粒介导的显性负性TGF-βII型受体在后左心房表达使纤维化减少50%，降低AF诱导性，减少传导异质性，并降低动作电位恢复曲线的最大斜率（从3.10±0.78降至1.09±0.17）。

凋亡调控是一种有前景的AF基因治疗策略。在犬类模型中，调节氧化应激的超氧化物歧化酶-1（SOD1）失调 contributes to AF进展。左神经节丛中微RNA 206（SOD1调节因子）的慢病毒抑制降低了AF易感性并延长动作电位时程。抑制关键凋亡酶caspase-3提供了另一种减少AF相关凋亡的策略。在猪模型中，靶向caspase-3的腺病毒siRNA减少了心房凋亡并延迟了持续性AF发生。

炎症 contributes to AF基质的建立和进展。NLRP3炎症小体通过促炎细胞因子和电重构在AF发展中起重要作用。AAV9介导的心肌细胞特异性NLRP3敲低使AAV9-shNLRP3治疗后AF诱导性降至20%（对照组为77.8%），并显著减轻结构心房重构，证明了AAV基于基因敲低炎症小体组件在AF中的治疗潜力。

电重构

钾电流（I_K）在心房复极化中起关键作用，其失调 significantly contributes to AF的发生和维持。AF中，增加的I_K1和I_K,Ach电流缩短动作电位时程（APD）和有效不应期（ERP），促进折返电路和心律失常发生。NOX2诱导的氧化应激激活蛋白激酶C epsilon（PKCε），进而增强乙酰胆碱调节的钾电流（I_K,H）—AF易感性的贡献者。该 maladaptive 通路可被shRNA介导的NOX2敲低所减弱，从而减少PKC转位和I_K,H上调。

晚钠电流（I_Na,L）通过延长动作电位时程和增加细胞内钙超载 contributes to AF，促进电不稳定性并通过延迟后除极（DADs）触发活动。传统治疗策略聚焦于减少Na_V1.5通道活性或调节其调控因子如钙调蛋白激酶II（CaMKII）以防止过量钠内流。尽管基因疗法在其他心律失常背景下靶向过CaMKII，但目前尚无基因治疗策略被证明能直接在AF模型中抑制I_Na,L。CaMKII在AF病理生理中的作用及其作为基因治疗靶点的潜力在“氧化应激”章节阐述。

L型钙通道（LTCC）介导向内钙电流（I_Ca,L），是心脏动作电位的组成部分，其减少与AF相关。通过上调或基因替代增加I_Ca,L密度的基因疗法可能逆转AF病理生理。但该方法的潜在缺点在于细胞内钙毒性，此为AF早期特征且可能自身驱动L型钙通道的后续下调。 indeed，慢性AF患者的心房肌细胞表现出较窦律对照组降低的I_Ca,L密度。值得注意的是，在兔AF模型中，自噬基因ATG7的慢病毒敲低恢复了Cav1.2表达并使I_Ca,L正常化，延长了AERP并降低了AF易感性，展示了一种有前景的基于基因的策略以 rescue 钙电流而无需直接过表达离子通道。

间隙连接在心脏电传导中起核心作用，其失调与AF相关。间隙连接由连接蛋白组成，Cx40和Cx43在心房组织中 predominant。在猪快速心房起搏模型中，心外膜基因注射加电穿孔递送编码Cx43的腺病毒载体使Cx43蛋白增加2.5倍， preserved LVEF，并较对照组提高传导速度。此外， treated pigs中未发生持续性AF（0/7），而对照组为5/6。

副交感神经系统主要通过迷走神经信号在AF病理生理中发挥作用。迷走末梢释放的乙酰胆碱激活心房肌细胞中的毒蕈碱2型受体（M2Rs），抑制腺苷酸环化酶并激活I_K-ACh，从而缩短心房不应期并促进折返性心律失常。后左心房中G蛋白信号的特异性抑制已被探索为一种基因治疗策略，以选择性减弱副交感影响并降低AF诱导性。在犬类模型中，腺病毒递送抑制性G蛋白α亚基（G_αi）抑制剂G_αi2ct至后左心房显著增加了有效不应期并使AF诱导性降低69%。

氧化应激

活性氧（ROS）通过过量产生或抗氧化酶不足而积累，导致氧化应激，这是AF发病的主要贡献者。氧化应激通过引起离子通道 dysfunction contributes to 电重构，并通过驱动炎症和纤维化 contributes to 结构重构。氧化应激还导致钙处理 impairment 和自主神经系统 dysfunction。靶向氧化应激来源已成为AF基因治疗的潜在策略。

正常情况下，NADPH氧化酶（NOX）家族（特别是NOX2和NOX4）维持心脏ROS的生理水平，支持细胞信号传导和肥大等功能。NOX催化的核心酶反应涉及电子从NADPH转移至氧，导致超氧化物形成。上调NOX酶的AF触发因素包括心房 stretch。如前所述，NOX2表达的减弱在犬类模型中减少了氧化损伤并预防了AF发生。

CaMKII调节心脏兴奋-收缩偶联，通过磷酸化离子通道和钙处理蛋白将钙信号转化为细胞响应。氧化应激通过触发CaMKII介导的ryanodine受体2（RyR2）在丝氨酸2814位点的磷酸化 promotes AF，增加肌浆网钙释放并促进钙波，从而引起后除极。此外，CaMKII磷酸化Nav1.5丝氨酸571，增强晚钠电流， contributes to 传导减慢和异质性，进一步促进对AF pathogenesis 关键的折返机制。编码CaMKII抑制肽CaMKIIn的腺病毒在猪模型中降低了AF易感性，显著改善了窦性心律维持并减轻了结构重构。具体而言，CaMKII抑制减少了心房纤维化、凋亡和肥大，心肌细胞凋亡从约1.9%降至约0.75%，同时保持了心房收缩功能。

临床展望与未来方向

尽管心血管基因治疗进展迅速，但AF的临床转化仍处于初期。缺乏AF聚焦试验凸显了其多因素性质带来的挑战。近期临床前工作显示出AAV9介导的心房靶向、RNA based approaches 及新型递送系统的前景。改善心房特异性靶向仍是优先事项。衣壳工程、非病毒载体和心房选择性启动子的进展可能提高精准性和安全性。实现长期表达而无 adverse 基因组整合 also key。随着研究继续阐明AF的分子基础，基因治疗日益定位于预防或逆转其遗传根源。