TDZ诱导的藤三七愈伤组织培养：抗氧化与抗衰老活性及其在植物化妆品中的应用前景

《Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC)》：Thidiazuron-mediated callus culture in Ivy gourd (Coccinia grandis (L.) Voigt) as a promising source of antioxidant and anti-aging potential for phytocosmeceutical applications

本研究针对野生藤三七资源有限且活性成分产量不稳定的问题，首次建立了噻苯隆(TDZ)诱导的藤三七愈伤组织培养体系。研究发现MS培养基中添加0.5 mg/L TDZ和0.2 mg/L NAA时，愈伤组织生物量最高(鲜重162.87 g/L，干重8.39 g/L)，其提取物表现出优异的抗氧化活性(FRAP 605.16 μg TE/g DW，ABTS 255.80 μg TE/g DW)和显著的抗衰老潜力(抗糖基化抑制率58.53%，酪氨酸酶抑制率41.06%，弹性蛋白酶抑制率70.24%，胶原酶抑制率72.48%)。LC-ESI-QTOF-MS/MS分析鉴定芦丁为主要黄酮成分。该研究为藤三七活性成分的可持续生产提供了创新平台，在植物药物和化妆品领域具有重要应用价值。

　　

在现代医学和化妆品研发领域，从天然资源中寻找高效、安全的活性成分一直是科学研究的热点。植物作为生物活性化合物的宝库，长期以来为人类健康提供了诸多解决方案。然而，传统采集野生植物资源的方式面临着严峻挑战：过度开采导致自然资源枯竭，环境因素（如温度、水分、土壤条件等）的不可控性直接影响植物中活性成分的产量和质量。以藤三七（Coccinia grandis (L.) Voigt）为例，这种在东南亚地区广泛食用的葫芦科植物富含多种药理活性成分，包括抗糖尿病、抗氧化、抗菌等多种功效，但其野生资源的可持续利用已成为亟待解决的问题。

植物细胞和组织培养技术的出现为这一困境带来了转机。该技术不仅能够实现植物活性成分的可持续生产，避免对野生资源的依赖，还能通过精确控制培养条件，获得质量稳定、适合药物和化妆品开发的提取物。在众多植物组织培养技术中，愈伤组织培养因其能够保持植物细胞的全能性，成为再生特定组织、建立细胞悬浮培养或培育转基因植物的基础平台。

尽管藤三七具有重要的药用价值，但关于其植物组织培养的研究却相对有限。此前的研究多使用激动素、6-苄氨基嘌呤(BAP)等细胞分裂素，以及2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、吲哚-3-乙酸(IAA)和1-萘乙酸(NAA)等生长素来诱导愈伤组织，但这些激素的效果仍有提升空间。而噻苯隆(TDZ)作为一种强效的细胞分裂素类似物，虽然在许多植物物种中表现出优异的愈伤组织诱导能力，但在藤三七中的应用尚未见报道。

在此背景下，研究人员开展了一项创新性研究，首次将TDZ应用于藤三七愈伤组织诱导，并系统评估了所得愈伤组织提取物的抗氧化和抗衰老活性。该研究旨在建立高效的藤三七愈伤组织培养体系，为其活性成分的可持续生产提供新策略，同时拓展其在药物和化妆品领域的应用前景。

研究采用的关键技术方法包括：以30天苗龄的藤三七无菌苗为外植体来源，在添加不同浓度TDZ（0.1-10 mg/L）和固定浓度NAA（0.2 mg/L）的MS培养基中进行愈伤组织诱导；通过超声辅助提取获得愈伤组织乙醇提取物；采用Folin-Ciocalteu法和氯化铝比色法分别测定总酚含量(TPC)和总黄酮含量(TFC)；通过DPPH、FRAP和ABTS实验评估抗氧化活性；采用BSA-葡萄糖模型评估抗糖基化活性；通过α-葡萄糖苷酶抑制实验评估抗糖尿病潜力；并测定对酪氨酸酶、弹性蛋白酶和胶原酶的抑制活性来评估抗衰老效果；最后利用LC-ESI-QTOF-MS/MS技术进行植物化学成分定性分析。

TDZ对藤三七愈伤组织诱导和生物量生产的影响

研究首次评估了TDZ作为细胞分裂素类似物对藤三七愈伤组织形成的诱导效果。在含有固定浓度NAA（0.2 mg/L）的MS培养基中，测试了五个TDZ浓度（0.1、0.5、1、5和10 mg/L）。培养7天后，所有TDZ浓度下均观察到愈伤组织形成，且愈伤组织诱导频率达到100%。作为对照，仅含NAA（0.2 mg/L）而不含TDZ的培养物未形成愈伤组织，而是出现了根的生长。

第二次继代培养后，所有TDZ浓度下的愈伤组织均呈现黄色、易碎的组织形态。TDZ 1 mg/L处理获得最大鲜重（285.40 g/L），而TDZ 10 mg/L处理获得最高干重（10.17 g/L）。相比之下，TDZ 0.5 mg/L处理的生物量最低，鲜重和干重分别为162.87 g/L和8.39 g/L。尽管各TDZ浓度间的干重无显著统计学差异，但考虑到长期培养中内源激素平衡的维持和成本效益，较低浓度的TDZ可能更具优势。

总酚和总黄酮含量（TPC和TFC）

植物激素浓度和平衡对愈伤组织形成和植物特异性代谢物生产至关重要。TDZ此前已被报道能通过激活苯丙氨酸解氨酶(PAL)刺激苯丙烷途径，从而增强酚类和黄酮类化合物的生物合成。本研究显示，TDZ 0.5 mg/L处理获得最高TPC（311.35 μg GAE/g DW）和TFC（545.06 μg QE/g DW），而TDZ 0.1 mg/L处理TPC最低（215.92 μg GAE/g DW），TDZ 10 mg/L处理TFC最低（251.03 μg QE/g DW）。五组TDZ浓度间的TPC无显著差异，TFC在TDZ 0.5、1和5 mg/L间也无显著差异。这些结果表明，TDZ 0.5 mg/L是促进藤三七愈伤组织酚类和黄酮类化合物积累的最佳浓度。

与野生藤三七叶片相比（TPC为1200.0±31.0 μg GAE/g DW），愈伤组织提取物中的TPC和TFC均较低。这种差异可能源于实验室培养条件缺乏生物和非生物胁迫，而这些胁迫在野生植物中通常会刺激次级代谢物的产生。

体外细胞游离抗氧化活性

活性氧(ROS)是导致细胞损伤的主要因素之一，会引起脂质过氧化、蛋白质和DNA损伤，并导致多种氧化应激相关疾病，包括加速细胞衰老。本研究通过DPPH、FRAP和ABTS三种互补实验评估了藤三七愈伤组织提取物的体外抗氧化能力。

所有抗氧化活性均以μg Trolox当量(TE)/g干重(DW)表示。TDZ 10 mg/L处理获得最高的DPPH清除活性（283.53 μg TE/g DW），但与TDZ 0.5和5 mg/L无显著差异。TDZ 1 mg/L处理的DPPH活性最低（206.35 μg TE/g DW）。值得注意的是，TDZ 0.5 mg/L处理的愈伤组织提取物在FRAP（605.16 μg TE/g DW）和ABTS（255.80 μg TE/g DW）实验中表现出最高的抗氧化活性。这些发现与这些提取物中较高的总酚和总黄酮含量密切相关，支持了酚类和黄酮类化合物对抗氧化能力有重要贡献的观点。

抗衰老活性的发现

晚期糖基化终末产物(AGEs)是通过还原糖的活性羰基与核酸、脂质或蛋白质之间的不可逆非酶促反应产生的有害分子。这个过程会导致活性氧(ROS)的产生，引发氧化应激和慢性炎症，最终导致蛋白质功能障碍、细胞凋亡和组织损伤，在各种年龄相关疾病的发生发展中起关键作用。

本研究首次报道了藤三七愈伤组织提取物的抗AGEs活性。TDZ 0.5 mg/L处理的提取物对AGEs形成的抑制率最高（58.53%），而TDZ 10 mg/L处理的抑制率最低（42.07%）。虽然这些值低于阳性对照氨基胍（89.83%抑制率），但仍显示出良好的抗糖基化潜力。

藤三七愈伤组织提取物的抗α-葡萄糖苷酶活性

研究还评估了不同TDZ浓度处理的藤三七愈伤组织提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。TDZ 1 mg/L处理的提取物抑制活性最高（IC₅₀=790.10±8.20 μg/mL），而TDZ 0.5和5 mg/L处理的活性最弱（IC₅₀分别为1287.07±9.36 μg/mL和1243.93±36.77 μg/mL）。这些结果表明TDZ处理通过调节生物活性次级代谢物的生产，显著影响藤三七愈伤组织的抗糖尿病潜力。

皮肤抗衰老潜力：酪氨酸酶、弹性蛋白酶和胶原酶抑制

为寻找具有皮肤抗衰老和美白特性的天然成分，研究评估了藤三七愈伤组织提取物对三种关键酶（酪氨酸酶、弹性蛋白酶和胶原酶）的抑制潜力。所有提取物均表现出对这三种酶的抑制活性，其中对弹性蛋白酶和胶原酶的抑制尤为显著。

TDZ 0.5 mg/L处理的提取物对弹性蛋白酶（70.24±1.36%）和胶原酶（72.48±3.74%）的抑制率最高，而TDZ 5 mg/L处理的弹性蛋白酶抑制率最低（60.46±0.07%），TDZ 10 mg/L处理的胶原酶抑制率最低（51.86±4.06%）。相反，酪氨酸酶抑制率在TDZ 10 mg/L处理时最高（53.24±1.73%），在TDZ 0.5 mg/L处理时最低（41.06±1.27%）。这些发现表明，除酚类和黄酮类化合物外，其他成分也可能参与了对酪氨酸酶的抑制活性。

相关性分析

为探究植物化学成分（TPC和TFC）与生物活性之间的关系，研究人员进行了Pearson相关性分析。结果显示TPC与DPPH抗氧化活性高度相关，与FRAP、ABTS和抗α-葡萄糖苷酶活性中度相关。TFC与抗胶原酶活性呈强相关且具有统计学显著性（p<0.01），与抗氧化活性（特别是FRAP和ABTS）也高度相关。这一发现与先前关于黄酮类化合物在抑制胶原酶活性中起关键作用的报道一致。

LC-ESI-QTOF-MS/MS植物化学成分分析

作为首次研究TDZ和NAA诱导的藤三七愈伤组织提取物，研究人员对提取物进行了定性植物化学成分分析。选择在MS培养基中添加0.5 mg/L TDZ和0.2 mg/L NAA培养的愈伤组织提取物进行分析，因为该条件表现出优异的生物量生产、总酚和总黄酮含量、抗氧化能力和抗衰老活性。

共鉴定出11种代谢物，包括初级和次级代谢物。在次级代谢物中，检测到了黄酮醇苷芦丁（槲皮素-3-O-芸香糖苷）。芦丁此前已在藤三七叶片和果实提取物中有报道，近期研究显示其在叶片中的浓度高于果实。基于先前研究，芦丁是一种关键的生物活性化合物，以其抗氧化和抗衰老特性闻名，包括抗糖基化、抗α-葡萄糖苷酶、抗酪氨酸酶、抗弹性蛋白酶和抗胶原酶活性，被认为对藤三七愈伤组织提取物观察到的生物活性有重要贡献。

研究结论与展望

本研究首次成功利用TDZ联合NAA诱导了藤三七愈伤组织培养，确定了0.5 mg/L TDZ和0.2 mg/L NAA的MS培养基为最佳愈伤组织诱导和培养条件。获得的乙醇愈伤组织提取物表现出良好的生物活性，包括抗氧化潜力（通过DPPH、FRAP和ABTS实验评估）和抗衰老效果（如对AGEs、α-葡萄糖苷酶、酪氨酸酶、弹性蛋白酶和胶原酶的抑制）。特别是提取物显示出强大的抗弹性蛋白酶和抗胶原酶活性，突出了其在植物化妆品开发中的应用潜力。

LC-ESI-QTOF-MS/MS植物化学分析鉴定芦丁为愈伤组织提取物中的主要黄酮成分，支持了其对抗观察到的生物活性的贡献。与野生植物相比，愈伤组织提取物中植物化学物质的多样性和数量较低，可能源于体外培养条件缺乏环境胁迫，而这些胁迫能够增强野生植物中次级代谢物的生产。

该研究为藤三七活性成分的可持续生产提供了创新平台，在植物药物和化妆品领域具有重要应用价值。未来研究可探索将愈伤组织培养扩大到生物反应器中的细胞悬浮系统，以实现生物活性代谢物的大规模可持续生产。使用诱导剂（如单色光、茉莉酸甲酯、酵母提取物或微生物）来增强次级代谢物（特别是酚类和黄酮类）的积累，有望提高提取物的质量和效力。此外，全面的毒性评估对于确保藤三七愈伤组织提取物在药物或化妆品应用中的安全性至关重要。

总之，这项研究为藤三七愈伤组织培养及其生物活性提供了宝贵见解，为未来创新植物化妆品产品的研发奠定了基础。通过优化培养条件和增强代谢物生产，藤三七愈伤组织培养有望成为高质量、标准化植物活性成分的可持续来源，满足日益增长的天然药物和化妆品市场需求。