克氏锥虫转唾液酸酶SAPA重复序列通过RNA与蛋白免疫诱导保护性免疫并促进炎症平衡反应

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：RNA and protein immunization with Trypanosoma cruzi trans-sialidase containing SAPA repeats protects mice against infection and promotes a balanced inflammatory response

本研究发现，克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）转唾液酸酶（TS）所含的SAPA重复结构域虽不显著影响免疫保护效力，但能显著提升IL-10分泌并减轻心脏炎症浸润。研究通过蛋白质与RNA两种疫苗平台证实，SAPA可引导免疫反应向抗炎表型倾斜，为开发兼具保护效力与免疫平衡功能的恰加斯病疫苗提供了关键理论依据。

　　

1 引言

克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）是引起恰加斯病（Chagas disease, CD）的原生动物寄生虫，其生命周期在锥蝽昆虫与哺乳动物之间交替。尽管发现已逾百年，恰加斯病仍是全球健康的重要负担，约600–700万人感染，每年导致约5万人死亡，且目前尚无可用疫苗。非媒介传播方式，如器官移植、输血、口腔感染和垂直传播，在多地仍构成显著风险。

该寄生虫的表面蛋白家族——转唾液酸酶（Trans-sialidase, TS），在宿主糖缀合物与寄生虫黏蛋白之间转移唾液酸，是感染过程中的关键分子。其中，C端免疫原性结构域包含称为SAPA（Shed Acute Phase Antigen）的氨基酸重复序列。TS在感染过程中介导多种生物学效应，并因其在感染中的关键作用，被反复测试作为CD疫苗候选分子。

2 材料与方法

2.1 序列分析与表位预测

研究利用免疫表位数据库（IEDB）和NetMHCIIpan 4.0等工具，对TS蛋白的HLA-I和HLA-II限制性表位以及B细胞线性表位进行预测。使用BLAST比对不同虫株（Y、Brazil、Dm28c）中TS基因的同源序列，并通过MEME和Tandem Repeats Finder鉴定SAPA重复的数量与模式。

2.2 质粒构建与蛋白表达

以克氏锥虫CL Brener株TS基因（TcCLB.509495.30）为模板，通过PCR扩增获得全长TS、不含SAPA的催化结构域（TS without SAPA）以及仅含SAPA重复的结构域（TS-SAPA）。产物克隆至pET21a表达载体，转化至SHuffle^? T7 Competent大肠杆菌中表达，并通过镍柱纯化获得重组蛋白。

2.3 mRNA合成与LNP封装

密码子优化的TS序列（含或不含SAPA）由GenScript合成，并通过T7 MegaScript试剂盒进行体外转录，使用N1-甲基假尿苷替代尿苷，共转录加帽。mRNA经脂质纳米颗粒（LNP）封装后用于体内免疫。

2.4 动物免疫与攻击实验

BALB/c小鼠分别通过皮下注射（蛋白+佐剂）或肌肉注射（LNP-mRNA）进行初免-加强免疫。30天后，用表达荧光素酶的Y株血液锥鞭毛体（10⁴）攻击感染，通过血寄生虫计数、活体成像、组织qPCR和组织学分析评估保护效果与炎症反应。

2.5 免疫应答检测

通过Western blot和ELISA分析抗体应答与亚类；通过脾细胞培养与细胞因子检测分析IFN-γ、IL-10等分泌水平。

3 结果

3.1 TS基因库与SAPA重复的分布

不同虫株中TS基因拷贝数差异显著（Brazil:1644, Dm28c:1491, Y:1465, CL Brener:3209），但编码活性酶的TS序列均含有SAPA重复域，重复次数2–29不等。表位预测显示，催化域富含T细胞表位，而SAPA区域以B细胞表位为主。

3.2 SAPA重复在急性感染中具有免疫优势性

Western blot结果显示，急性感染小鼠血清仅识别SAPA重复域，而不识别催化域；慢性患者血清则识别催化域而非重复域，证实SAPA在急性期具有B细胞免疫优势性。

3.3 SAPA引导抗炎免疫反应

免疫全长TS蛋白诱导的抗体主要靶向SAPA域；而免疫不含SAPA的TS则引发对催化域的应答。全长TS免疫诱导更高水平的IL-10分泌，并显著降低心脏炎症浸润，显示其抗炎潜力。

3.4 催化域是保护性免疫所必需的

攻击实验显示，免疫全长TS或不含SAPA的TS均可显著降低寄生虫血症（降低78–83%），而仅免疫SAPA域则保护效果较弱（降低约49%）。组织qPCR显示，全长TS免疫组心脏寄生虫DNA载量最低。

3.5 RNA疫苗验证SAPA的抗炎作用

RNA免疫与蛋白免疫结果一致：全长TS RNA诱导更高水平的IL-10和更平衡的IgG2a/IgG1比值，并显著减轻感染后心脏炎症。

3.6 RNA疫苗提供显著保护并调节炎症

两种RNA疫苗（含或不含SAPA）均能显著控制寄生虫血症，但全长TS RNA免疫组心脏寄生虫DNA更少、炎症浸润更轻，提示其诱导的免疫反应更具保护性与平衡性。

4 讨论

研究证实，尽管SAPA重复域不直接影响疫苗的保护效力，但其通过促进IL-10分泌、抑制过度炎症反应，显著改善感染后的心脏病理状况。这一发现挑战了“重复域不利于有效免疫”的传统观点，表明在疫苗设计中保留免疫优势性重复结构域可能有助于实现保护与免疫平衡的双重目标。

RNA疫苗平台不仅展现出与重组蛋白相当的保护效果，还因其灵活、高效的抗原表达方式，为多抗原联合疫苗的开发提供新路径。本研究为恰加斯病疫苗的优化设计提供了重要理论与实践依据，也为其他寄生性疾病疫苗研究提供了可借鉴的策略。