雷公藤多苷通过多靶点协同作用克服卵巢癌顺铂耐药性的机制研究：聚焦生物碱成分的网络药理学与实验验证

《Frontiers in Pharmacology》：Alkaloid-driven multi-target synergy of Tripterygium wilfordii polyglycosides overcomes cisplatin resistance in ovarian cancer by coordinated inhibition of PTPN11/EGFR/JAK signaling

本研究通过整合UPLC-QTOF-MS化学分析、网络药理学、分子对接与动力学模拟及体外实验，系统阐明了雷公藤多苷（TWP）克服卵巢癌顺铂耐药的新机制。研究发现TWP中的生物碱成分是关键活性物质，能协同靶向EGFR、JAK1/2、PTPN11、SRD5A1等核心靶点，进而抑制PI3K-AKT、JAK-STAT和ERK-MAPK信号通路，诱导细胞凋亡，逆转耐药性。该研究为TWP这一已获批抗炎药物的肿瘤治疗适应症拓展提供了理论依据。

　　

雷公藤多苷（TWP）是一种来源于雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook. f.）的标准化口服提取物，已获中国国家药品监督管理局（NMPA）批准用于治疗炎症和自身免疫性疾病。近年研究发现TWP具有显著的抗肿瘤活性，包括抑制卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭，甚至能逆转顺铂耐药。然而，其确切分子机制，特别是其中生物碱类成分的具体贡献，尚不明确。传统上，TWP的抗肿瘤作用多归因于其二萜类成分，而生物碱这一具有强大生物活性潜力的成分家族（以如小檗碱等药物为代表）的作用却被相对忽视。为了填补这一知识空白，本研究采用多维整合策略，系统解析了TWP的化学成分，并深入探究了其克服顺铂耐药的作用机制。

UPLC/Q-TOF-MS基于TWP的定性分析

采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC/Q-TOF-MS）对TWP进行化学成分分析。在正离子模式下共鉴定出38种化学成分。根据[M + H]⁺离子、碎片裂解模式、对照品及文献比对，最终注释了18种生物碱、8种二萜类、8种三萜类以及4种其他类型化合物。生物碱成为TWP中数量最多的化学类别，这提示其可能在TWP的整体生物活性中扮演重要角色。

TWP卵巢癌相关靶点的筛选与分析

通过SwissTargetPrediction预测TWP成分的潜在分子靶点，获得743个独特靶点。同时，从GeneCards、OMIM和CTD数据库收集到5156个卵巢癌相关基因。维恩图分析显示，TWP预测靶点与卵巢癌相关基因存在242个重叠靶点，这些靶点可能介导了TWP抗卵巢癌的治疗效应。

TWP与卵巢癌靶点的网络分析

构建了“成分-靶点”二分网络进行可视化分析。该网络包含268个节点（26个成分，242个靶点）和1274条边，反映了TWP多成分、多靶点的药理特点。拓扑学分析识别出连接度高的成分，可能代表关键药理活性物质。网络中度值（Degree）排名前10的成分主要为生物碱（如雷公藤吉碱A（wilfordinine A）、雷公藤定碱（wilforidine）、雷公藤宁碱A（wilfornine A）、雷公藤春碱（wilfortrine）、南蛇藤肉桂酰胺碱D（euojaponine D）等），这与化学分析结果一致，并提示生物碱是TWP抗卵巢癌效应的主要介质。

PPI网络分析

使用STRING数据库构建了242个重叠靶点的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。利用Cytoscape的CytoHubba和MCODE插件进行深入分析。MCODE识别出三个紧密连接的子网络：子网络1（评分：10.364）富集于信号通路相关蛋白（12个节点，57条边），包含JAK1、JAK2、EGFR、PIK3CA、PIK3CB和PTPN11等。子网络2（评分：9.000）与类固醇激素生物合成相关（9个节点，36条边），包括SRD5A1、CYP17A1和AKR1C3。子网络3（评分：5.500）参与炎症/凋亡调控（13个节点，27条边），包含PRKCA、PRKCB、HSP90AA1和SRC。同时，CytoHubba根据度中心性识别出前10个枢纽基因（Hub Genes）：SRD5A1、PTPN11、PIK3CA、PIK3CB、JAK2、EGFR、PTPN6、JAK1、AKR1C3和CYP17A1。这些基因汇聚于JAK-STAT、PI3K-Akt、酪氨酸激酶信号等癌症相关通路，阐明了它们在TWP抗卵巢癌效应中的核心作用。

GO富集和KEGG通路分析

对242个靶点进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。结果显示显著富集（p < 0.01）于693个生物过程（BP）、95个细胞组分（CC）、187个分子功能（MF）和167条KEGG通路。富集程度最高的条目包括：BP：蛋白质磷酸化、对外源刺激的反应、肽基-丝氨酸磷酸化、炎症反应等。MF：蛋白激酶活性、ATP结合、酶结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性等。CC：细胞质、胞质溶胶、质膜、细胞外外泌体等。KEGG：癌症通路（如Pathways in cancer, Prostate cancer）、信号级联（如EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）和免疫调节（如PD-L1/PD-1 checkpoint pathway）等。这些结果提示TWP通过多通路调节影响增殖、凋亡、炎症和免疫反应。

微阵列验证临床数据集中的核心靶点

分析了四个独立的卵巢癌微阵列数据集（GSE18520, GSE26712, GSE27651, GSE54388）以验证枢纽基因的临床相关性。利用严格标准（调整后p < 0.05，|log2(差异倍数FC)|≥1）识别差异表达基因（DEGs）。在前10个枢纽基因中，有五个核心靶点（PTPN11、JAK2、EGFR、SRD5A1和JAK1）在至少两个数据集中表现出一致的差异表达。这五个兼具网络中心性和临床样本差异表达特征的基因被指定为核心靶点，用于后续分析。

分子对接验证TWP活性成分与核心靶点的结合

为系统评估代表性TWP成分与五个核心靶点（EGFR, JAK1, JAK2, PTPN11, SRD5A1）的结合潜力，使用AutoDock Vina对网络连接度最高的10个TWP化合物进行了分子对接。结合自由能（ΔG）≤ -5 kcal/mol设定为有效结合阈值，ΔG ≤ -7 kcal/mol定义为强结合。热图分析显示，所有成分-靶点对的ΔG均≤ -5 kcal/mol，其中27对达到ΔG ≤ -7 kcal/mol，表明结合广泛且稳健。比较评估确定了每个靶点的最佳配体：EGFR-雷公藤吉碱A（-9.2 kcal/mol）、JAK1-迈泰因（-8.8 kcal/mol）、JAK2-雷公藤吉碱F（-8.5 kcal/mol）、PTPN11-雷公藤宁碱A（-7.8 kcal/mol）、SRD5A1-南蛇藤肉桂酰胺碱D（-9.5 kcal/mol）。详细构象分析表明，TWP成分通过氢键、疏水作用、π-π堆积和范德华力锚定在催化口袋内。

MD模拟分析

为探究 top-ranked 复合物的热力学稳定性和构象动力学，对上述五对最佳组合进行了100纳秒（ns）的全原子分子动力学（MD）模拟。通过均方根偏差（RMSD）和均方根波动（RMSF）分别量化结构稳定性和残基柔性。RMSD轨迹表明所有体系均能快速收敛至平衡状态。配体RMSD全程保持在<0.2 nm，证实了结合构象的持久性。RMSF谱图显示，柔性环区和末端占残基移动性的主要部分，而催化核心保持刚性。收敛的RMSD和结合位点残基受限的RMSF共同验证了对接预测的构象，并强调了预测的TWP-靶点相互作用的可靠性。

TWP抑制卵巢癌细胞活力

通过CCK-8法在SKOV3和顺铂耐药A2780/DDP细胞中验证了TWP的预测抗肿瘤活性。处理24小时后，TWP在两种细胞系中均呈浓度依赖性降低细胞活力。值得注意的是，10 μM顺铂对SKOV3细胞有强抑制作用，但对A2780/DDP细胞仅产生微弱的细胞毒性，证实了其耐药性。而TWP对该耐药细胞系仍保持强效活性，凸显了其治疗顺铂耐药卵巢癌的潜力。

TWP诱导顺铂耐药细胞凋亡

通过Annexin V-FITC/PI流式细胞术和Western blot验证TWP在A2780/DDP细胞中是否能引发程序性细胞死亡。TWP处理24小时后，能浓度依赖性地增加总凋亡率（早期+晚期）。Western blot分析揭示了相应的分子特征：Bax和cleaved Caspase-3表达上调，而Bcl-2表达下调，导致Bcl-2/Bax比值显著降低。这些数据证明TWP通过改变Bcl-2家族平衡和激活Caspase-3介导的内源性凋亡通路来克服顺铂耐药。

TWP在顺铂耐药A2780/DDP细胞中抑制EGFR/JAK/PTPN11信号

为验证网络药理学的预测，用TWP处理A2780/DDP细胞24小时后进行Western blot分析。结果显示，TWP能浓度依赖性地降低EGFR、JAK1、JAK2和PTPN11的磷酸化水平。总EGFR和JAK2蛋白水平未变，而总JAK1和PTPN11仅在20 μg/mL时轻微降低。SRD5A1的表达在同一剂量下显著下降。这些结果表明TWP主要通过去磷酸化作用使上游激酶/磷酸酶失活，并在较高浓度下次级下调某些靶点，从而破坏顺铂耐药卵巢癌细胞中的多个促生长回路。

TWP抑制PI3K-AKT、JAK-STAT和ERK-MAPK信号通路

为验证TWP抑制上游信号分子所产生的下游效应，研究了TWP对三条主要信号级联的影响：PI3K-AKT、JAK-STAT和ERK-MAPK通路。Western blot分析表明，TWP处理导致A2780/DDP细胞中Akt、STAT3和ERK1/2的磷酸化水平浓度依赖性下降。重要的是，Akt、STAT3和ERK1/2的总蛋白水平在整个浓度范围内保持不变，证实TWP通过翻译后修饰（去磷酸化）而非转录或翻译抑制来调节通路活性。这为TWP能同时抑制顺铂耐药卵巢癌细胞中这三条关键的促生存信号通路提供了直接实验证据。

综上所述，本研究通过整合“预测-验证”策略，阐明了TWP，特别是其生物碱成分，通过多靶点协同作用克服卵巢癌顺铂耐药性的潜在机制。TWP通过靶向并抑制EGFR、JAK1/2、PTPN11等上游关键信号分子，并下调SRD5A1，进而协同阻遏PI3K-AKT、JAK-STAT和ERK-MAPK这三条重要的促生存信号通路，最终诱导细胞凋亡，逆转耐药表型。该研究不仅为理解TWP的抗卵巢癌作用提供了新的机制见解，也为将已获批的抗炎药物TWP重新定位用于肿瘤治疗，特别是克服铂类耐药，提供了重要的理论依据和转化前景。未来的研究可侧重于使用生物碱富集组分或单体进行验证，并利用患者来源的异种移植瘤（PDX）或类器官模型在更复杂的肿瘤微环境中进行功能确认。