利用抑制剂文库筛选小鼠早期胚胎发育新调控因子的创新研究及其在辅助生殖技术中的意义

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Screening for novel factors involved in mouse early embryonic development using inhibitor libraries

本研究开发了一种结合超数排卵与单细胞胚胎冷冻技术的高通量筛选系统，成功鉴定出16种调控小鼠受精卵发育的关键因子，包括p53激活剂（PRIMA-1）、组织蛋白酶D（Cathepsin D）、CXCR2受体和钾通道（SK2/SK3）等新型调控因子。通过CRISPR-Cas9基因敲除实验验证了Cathepsin D和CXCR2在胚胎发育中的关键作用，为揭示早期胚胎发育机制和改善辅助生殖技术（ART）提供了新视角。

　　

1 引言

不孕症已成为全球性健康问题，约每六人中就有一人受影响。提高辅助生殖技术（ART）成功率亟需深入理解受精、早期胚胎发育和植入过程中的关键调控因子。尽管组学技术如蛋白质组学和基因组学已发现许多发育相关因子，但利用抑制剂文库进行功能筛选仍是发现新调控因子的有效策略。本研究通过建立新型筛选系统，旨在发现小鼠早期胚胎发育中的未知调控因子。

2 材料与方法

研究采用C57BL/6N品系小鼠，通过超数排卵技术（HyperOva诱导）和体外受精（IVF）获取单细胞期胚胎，并采用冷冻保存技术确保遗传背景一致性。使用SCADS抑制剂文库（Kit II ver. 2.0和Kit III ver. 1.6）共95种抑制剂，以1μM终浓度处理胚胎。通过计算发育率（发育胚胎数/总胚胎数×100）评估抑制剂效果。采用CRISPR-Cas9系统进行基因敲除验证，通过电穿孔法将核糖核蛋白（RNP）复合体导入胚胎。表达分析利用GSE44183单细胞RNA-seq数据，免疫荧光染色检测蛋白定位。

3 结果

3.1 筛选条件优化

研究发现甲醇溶剂对胚胎发育具有显著毒性。当甲醇浓度达4.75%时，胚胎发育率降至2.60%±3.43%，而0.475%浓度下无显著影响，故后续实验采用0.475%甲醇（对应抑制剂浓度1μM）。比较发现，经超数排卵和冻融处理的胚胎（Cryo IVF）存在基线应激，较体内受精胚胎发育率显著降低。

3.2 新型发育调控因子的发现

通过筛选95种抑制剂，鉴定出16种显著影响胚胎发育的化合物，包括5种已知因子（如ATP酶抑制剂）和11种新型调控因子。聚类分析将抑制剂按发育阻滞阶段分为五类：I类（单细胞期致死）、II类（阻滞1-2细胞转化）、III类（无影响）、IV类（囊胚形成阻滞）和V类（4细胞-桑椹胚转化阻滞）。新发现的调控因子包括p53激活剂PRIMA-1、组织蛋白酶D（Cathepsin D）抑制剂、CXCR2抑制剂和钾通道抑制剂（SK2/SK3）。

3.3 基因功能验证

通过CRISPR-Cas9敲除Ctsd和Cxcr2基因验证其功能。Ctsd敲除胚胎在4细胞期后发育率显著下降，囊胚形成受阻；Cxcr2敲除同样导致囊胚发育异常。这些结果与抑制剂表型一致，证实两者在早期胚胎发育中的关键作用。表达分析显示Ctsd转录本从卵母细胞到桑椹胚持续表达，而Cxcr2表达量较低但存在于2细胞至桑椹胚期。免疫荧光染色证实CTSD蛋白从卵母细胞到囊胚均有表达，CXCR2信号在2细胞至桑椹胚期微弱 detectable。

4 讨论

本研究建立的筛选系统成功鉴定出多个新型胚胎发育调控因子。Cathepsin D作为天冬氨酸蛋白酶首次被证实参与4细胞至桑椹胚转化，可能与细胞紧致化或分裂过程相关。CXCR2作为GPCR受体，可能通过接收输卵管来源的配体（“胚胎因子”）调控早期发育。值得注意的是，CTSD和CXCR2在小鼠与人类胚胎中的表达模式存在物种差异，提示调控机制可能具有物种特异性。研究还发现不同ATP酶类型（F1-ATPase与V-ATPase）在特定发育阶段发挥独特作用，揭示了胚胎能量代谢的阶段特异性需求。

研究的局限性在于超数排卵和冻融程序可能引入基线应激，且抑制剂筛选仅采用单一浓度。未来需通过剂量响应实验、siRNA敲低和在体受精胚胎验证进一步确认候选因子功能。该系统可扩展至更广泛的抑制剂文库和其他物种，有望发现物种特异性发育调控因子，并为传统草药活性成分筛选和紧急避孕药开发提供新思路。