TaPSKR1L-6A过表达通过调控木质素合成增强小麦对纹枯病抗性的机制研究

《Frontiers in Plant Science》：Overexpression of TaPSKR1L-6A improves resistance to sharp eyespot and increases lignin accumulation in wheat

本研究揭示了小麦类植硫素受体1基因TaPSKR1L-6A在抗纹枯病中的关键作用。通过RNA-seq、病毒诱导基因沉默（VIGS）和转基因技术，发现TaPSKR1L-6A过表达可显著提高小麦对纹枯病菌（Rhizoctonia cerealis）的抗性，并激活木质素合成基因（TaPAL5、TaCOMT-3D等）表达，促进木质素积累。该基因与TaSERK1互作共同调控抗病通路，为小麦抗病育种提供了新靶点。

　　

TaPSKR1L-6A参与小麦对纹枯病的防御反应

通过分析抗感纹枯病的小麦重组自交系（RILs）的RNA-seq数据，研究人员发现位于6A染色体上的类植硫素受体1基因TraesCS6A02G222000.1（命名为TaPSKR1L-6A）在接种纹枯病菌（R. cerealis）菌株Rc207后，抗病RILs中的表达量显著高于感病RILs。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析进一步验证，在接种纹枯病菌后，抗病小麦品种CI12633中TaPSKR1L-6A的转录水平显著高于感病品种文麦6号。在四个不同小麦品种中，TaPSKR1L-6A的转录水平在抗病品种CI12633中最高，在山红麦中次之，而在高感品种扬麦9号和文麦6号中最低，表明其转录丰度与小麦品种的抗病程度呈正相关。

通过查询中国春小麦的组织特异性表达数据库，发现该基因在根和茎组织中表达水平较高，而在叶片和穗中较低，这与纹枯病的侵染和发生部位一致。在接种纹枯病菌4天后，CI12633幼苗的茎和叶鞘中该基因的表达变化更为显著，而这些部位正是纹枯病通常发生的部位。对61个小麦品种的TaPSKR1L-6A启动子区测序发现，在-1191位点存在一个单核苷酸多态性（SNP，T→C），形成了两个单倍型（Hap I和Hap II）。携带Hap I的小麦品种的病情指数显著低于携带Hap II的品种，表明Hap I单倍型与更高的纹枯病抗性相关。然而，仅有9.84%的小麦品种携带Hap I，暗示该单倍型在现代小麦育种过程中未被充分选择。

TaPSKR1L-6A正向调控小麦对纹枯病的抗性

为了研究TaPSKR1L-6A介导的小麦纹枯病抗性，研究人员通过大麦条纹花叶病毒（BSMV）介导的基因沉默（VIGS）技术构建了TaPSKR1L-6A沉默的小麦植株。在接种纹枯病菌RC207菌株30天后，与接种BSMV:GFP（对照）的CI12633植株相比，TaPSKR1L-6A沉默的CI12633植株茎部表现出更严重的纹枯病症状，坏死面积更大。在两批VIGS试验中，TaPSKR1L-6A沉默的CI12633植株的病情指数分别为59.2和62，而对照植株的病情指数分别为43.8和41.6。这些数据表明TaPSKR1L-6A的表达是小麦对纹枯病菌产生抗性所必需的。

为了进一步验证TaPSKR1L-6A在小麦纹枯病抗性反应中的功能，研究人员构建了TaPSKR1L-6A过表达的转基因小麦植株。在T₂代植株接种纹枯病菌RC207菌株30天后，过表达植株茎部的纹枯病病斑尺寸小于野生型（WT）植株。在抗病性评估中，三个TaPSKR1L-6A过表达小麦株系的病情指数分别为26.85、23.93和23.25，而野生型受体扬麦18植株的病情指数为52.16。这些结果表明，与野生型相比，过表达TaPSKR1L-6A能显著提高转基因小麦对纹枯病的抗性。

TaPSKR1L-6A正向调控小麦木质素合成

在评估转基因小麦对纹枯病的抗性过程中，研究人员发现TaPSKR1L-6A过表达小麦植株的茎秆强度似乎高于野生型扬麦18植株。因此，他们分析了过表达植株和野生型植株的木质素含量。结果显示，过表达植株的木质素含量显著高于野生型植株。进一步地，对过表达植株和野生型植株叶鞘的手切片进行Wiesner和M?ule染色，结果显示，与野生型样本相比，过表达植株的样本显示出更强的染色（红褐色），表明其木质素水平更高。此外，与野生型植株相比，过表达小麦植株具有更多的厚壁组织细胞，这也可以通过M?ule和Wiesner染色检测到。这些结果表明TaPSKR1L-6A的过表达增强了木质素的积累。最后，研究人员在收获期测量了过表达植株和扬麦18植株第二基节间茎秆的机械（折断）强度，结果显示过表达株系的机械强度显著增加。

为了探究过表达植株木质素含量升高的原因，研究人员测量了TaPSKR1L-6A过表达和沉默植株以及各自对照中几个木质素合成相关基因的表达。结果显示，在过表达植株中，木质素合成相关基因TaPAL5、TaCOMT-3D和TaCCR1的转录水平高于野生型（对照）植株。而在TaPSKR1L-6A沉默植株中，TaPAL5和TaCOMT-3D的转录水平显著低于对照植株，但TaCCR1的转录水平在沉默植株和对照植株之间无显著差异。这些结果表明TaPSKR1L-6A至少通过调控TaPAL5和TaCOMT-3D的表达来正向调节木质素合成。

此前的研究表明TaPSKR1L-6A可以与TaSERK1互作，共同调控小麦对镰刀菌冠腐病的抗性。为了分析TaSERK1是否与小麦木质素合成相关，研究人员构建了TaSERK1沉默的小麦植株，并检测了三个受TaPSKR1L-6A上调的木质素合成相关基因（TaPAL5、TaCOMT-3D和TaCCR1）的转录水平。结果显示，与对照植株相比，TaSERK1沉默植株中这三个基因的转录水平显著降低。这些数据表明TaPSKR1L-6A和TaSERK1共同调控木质素合成以增强茎秆强度。

讨论

近年来，主要由土传真菌纹枯病菌引起的纹枯病已成为世界多地小麦的重要毁灭性病害。鉴于纹枯病抗性的多基因特性，研究应侧重于扩展小麦抗病网络、鉴定主效数量性状位点（QTL），并利用分子标记聚合多个抗病基因，以逐步增强小麦对该病的抗性。尽管已有报道表明PSKR1基因在拟南芥、番茄和水稻中参与了对病原菌的先天免疫，但PSKR1在小麦抗病反应中的功能作用尚未见报道。本研究将TaPSKR1L-6A鉴定为小麦抗纹枯病的候选抗病基因，其在纹枯病菌侵染后的转录诱导在测试的抗病小麦品种中高于感病品种。进一步的功能解析结果表明，过表达TaPSKR1L-6A显著增强了小麦对纹枯病的抗性，而沉默该基因则削弱了抗性。综上所述，这些结果表明TaPSKR1L-6A赋予小麦对纹枯病的抗性，因此是一个用于改善小麦纹枯病抗性的有前景的基因。

由PSKR触发的免疫下游通路尚不完全清楚。在拟南芥中，AtCCR1对木质素合成很重要。在水稻中，OsPALs通过调节水杨酸和木质素的生物合成与积累来介导对褐飞虱的抗性。在小麦中，过表达TaCOMT-3D可通过促进木质素积累来增强小麦对纹枯病的抗性并提高茎秆机械强度，而沉默该基因则产生相反效应。本研究表明，过表达TaPSKR1L-6A提高了木质素合成基因（TaPAL5、TaCOMT-3D和TaCCR1）的表达，增加了转基因抗病株系的木质素含量/积累和茎秆强度，而沉默该基因则产生相反效应。此外，与野生型植株相比，过表达植株具有更多的厚壁组织细胞和更深的木质素染色，表明TaPSKR1L-6A的过表达增强了木质素积累并促进了维管束的发育。

此前研究证明TaPSKR1L-6A可与TaSERK1互作共同调控小麦对镰刀菌冠腐病的抗性。本研究发现，与对照小麦植株相比，TaSERK1沉默植株中TaPAL5、TaCOMT-3D和TaCCR1的表达水平降低。已有报道表明SERK蛋白与维管束的发育相关。综上所述，这些结果表明与TaSERK1互作的TaPSKR1L-6A共同调控木质素合成和茎秆强度，从而增强小麦对纹枯病的抗性。

据研究者所知，这是首次报道PSKR1或PSKR1L参与木质素合成和积累的研究。该发现丰富了PSKR1/L信号通路。当前的研究结果增进了对PSKR转导信号通路的认识。

结论

本研究证明TaPSKR1L-6A可通过激活木质素合成相关基因的表达和增加小麦木质素积累来赋予纹枯病抗性。过表达TaPSKR1L-6A显著增强了小麦对纹枯病的抗性并促进了木质素合成/积累。相反，沉默TaPSKR1L-6A和TaSERK1则产生相反的效应。据研究者所知，这是关于PSKR1/PSKR1L在木质素合成中调控作用的首次报道，也是关于过表达抗病基因提高小麦纹枯病抗性的首次报道。因此，TaPSKR1L-6A是培育抗纹枯病小麦品种的一个有前景的基因。本研究揭示了小麦对纹枯病菌的防御机制，并为理解PSKR1/PSKR1L在植物先天免疫，尤其是在重要作物小麦中的功能作用提供了见解。

材料与方法

研究所用植物材料包括表现出不同纹枯病抗感水平的四个小麦品种：CI12633、山红麦、扬麦9号和文麦6号，用于研究TaPSKR1L-6A在应对纹枯病菌侵染下的转录谱。中等抗病品种CI12633用于VIGS实验。中等感病品种扬麦30作为遗传转化的受体材料。所有小麦幼苗在光照14小时23°C、黑暗10小时15°C的温室中生长。

纹枯病菌强毒力菌株RC207由山东农业大学于金芬教授和张丽博士分离。该真菌菌株在PDA培养基上于25°C黑暗条件下培养。本研究所有引物序列见补充表S2。

本研究使用来自山红麦 × 文麦6号杂交组合的重组自交系（RILs）进行RNA测序（RNA-Seq）分析。用于RT-qPCR的靶基因引物使用Primer Premier 5软件设计。RT-qPCR使用SYBR Green SuperReal PreMix在ABI Prism 7500实时荧光定量PCR系统上进行。以TaActin基因作为RT-qPCR的内参基因。使用2^?ΔΔCT法计算靶基因的相对表达水平。

大麦条纹花叶病毒介导的VIGS已成功用于研究大麦和小麦的基因功能。本研究将TaPSKR1L-6A的一个207 bp片段亚克隆到BSMV RNA γ cDNA的Nhe I位点，形成BSMV:TaPSKR1L-6A重组构建体。携带空载体GFP的BSMV用作对照处理。然后，按照先前描述的方法分别接种这些病毒。接种BSMV 15天后，通过RT-qPCR检测基因沉默效率，并对沉默植株接种纹枯病菌进行抗病性评估。

从CI12633植株的cDNA中扩增出TaPSKR1L-6A的全长开放阅读框（ORF）序列。在该全长ORF序列上添加6-His表位标签，然后亚克隆到单子叶植物转化载体pWMB110中。所得pTaPSKR1L-6A-6His载体中，TaPSKR1L-6A-6His的转录由玉米泛素（Ubi）启动子驱动，并由根癌农杆菌胭脂碱合成酶（Tnos）基因的3‘非转录区终止。随后，通过农杆菌介导的转化将pTaPSKR1L-6A-6*His载体导入小麦品种扬麦18的未成熟胚中。通过PCR使用引物TaPSKR1L-6A-TF和Poly-R检测转基因小麦植株。

纹枯病的接种和病情评估方法参考已有研究工作。病情指数（DI）计算公式如上文所述。公式中的数字1–5代表不同小麦植株的纹枯病侵染型，X₀-X₅代表处于不同病害侵染型的植株数量。

在接种纹枯病菌4天后，收集T1代转基因或野生型扬麦18植株的基生叶鞘进行木质素染色。使用木质素ELISA试剂盒按照制造商方案定量测量木质素含量。对于木质素染色，从小麦植株的基茎制备新鲜的手切片。按照先前描述的方法进行Wiesner和M?ule染色，并在光学显微镜下观察。在收获期，使用质构分析仪（TA）采用三点弯曲测试设置，测量过表达植株和扬麦18植株第二基节间茎秆的机械（折断）强度。