青蒿素通过激活AKT/ERK信号通路发挥神经保护及抗抑郁作用

《Frontiers in Pharmacology》：Artemisinin exerts antidepressant-like effects via activation of AKT and ERK signaling pathways

本研究揭示青蒿素（ART）通过激活AKT/ERK信号通路，在皮质酮（CORT）诱导的PC12细胞和原代海马神经元模型中显著减轻氧化损伤、线粒体功能障碍和细胞凋亡，并在慢性不可预见温和应激（CUMS）小鼠模型中改善抑郁样行为，其作用涉及AKT/GSK3β/NRF2/HO1和BDNF/TrkB/ERK/CREB通路上调、星形胶质细胞活性调控及海马神经发生促进，为开发新型抗抑郁药物提供了实验依据。

　　

1 引言

抑郁症是一种主要的精神障碍，全球有超过3亿患者，预计到203年将成为全球残疾的首要原因。现有抗抑郁药如单胺氧化酶抑制剂（MAOIs）、三环类抗抑郁药（TCAs）和选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRIs）存在疗效不足和副作用等问题，约30%患者治疗无效，亟需开发新型药物。

青蒿素（ART）是从黄花蒿中提取的天然化合物，具有抗炎、神经保护等多种药理活性。其能透过血脑屏障（BBB），临床副作用小，在阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD）等神经退行性疾病模型中显示保护作用。近期研究表明青蒿素衍生物具有抗抑郁潜力，但青蒿素本身在抑郁模型中的作用尚不清楚。

抑郁症发病机制复杂，慢性应激导致下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴过度激活，产生过量糖皮质激素（如皮质酮CORT），对海马等脑区造成损伤。PC12细胞富含糖皮质激素受体，CORT诱导的PC12细胞损伤是常用的体外抑郁药理研究模型。慢性不可预见温和应激（CUMS）小鼠模型则能模拟人类抑郁的核心症状，如快感缺乏。

本研究旨在利用CORT诱导的PC12细胞模型和CUMS小鼠模型，探讨青蒿素的抗抑郁样活性及作用机制。

2 材料与方法

2.1 材料

青蒿素、CORT、氟西汀等试剂购自美仑生物等公司。抗体包括GAPDH、p-AKT、p-ERK等。使用MEK抑制剂PD98059和PI3K抑制剂LY294002进行通路抑制实验。

2.2 细胞培养与处理

PC12细胞和原代海马神经元用于实验。实验分组包括对照组、CORT组（200 μM）及CORT与青蒿素（3.125–100 μM）共处理组。

2.3-2.7 体外功能检测

采用MTT法检测细胞活力，LDH法检测细胞毒性，DCFH-DA探针检测活性氧（ROS）水平，JC-1染色检测线粒体膜电位（MMP, Δψm）， Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术检测细胞凋亡。

2.8-2.9 分子机制探究

使用CRISPR/Cas9技术敲低PC12细胞的AKT1基因。通过蛋白质印迹法（Western blot）分析相关蛋白表达。

2.10-2.13 动物实验

雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组、CUMS组、青蒿素（0.3, 1, 3 mg/kg）组和氟西汀（10 mg/kg）阳性对照组。药物在应激后每日腹腔注射，持续4周。行为学测试包括糖水偏好实验（SPT）、悬尾实验（TST）和强迫游泳实验（FST）。采用免疫组织化学和免疫荧光法检测海马CA1区胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和神经元核抗原（NeuN）的表达。

2.14 统计分析

体外实验至少独立重复3次，体内实验每组8只动物。数据以均值±标准差表示，采用t检验或单因素方差分析（ANOVA）后进行Tukey事后检验，P < 0.05认为有统计学意义。

3 结果

3.1 青蒿素减轻CORT诱导的PC12细胞活力下降

200 μM CORT处理48小时使PC12细胞活力显著降低30%。青蒿素（25 μM）与CORT共处理可剂量依赖性地逆转细胞活力下降，并将乳酸脱氢酶（LDH）泄漏率恢复至接近对照组水平。

3.2 青蒿素降低细胞内ROS水平并缓解CORT诱导的MMP降低

CORT处理使细胞内ROS水平显著升高至对照组的179.5%，而青蒿素共处理将其降至137%。JC-1染色显示CORT导致线粒体膜电位（Δψm）显著降低，青蒿素共处理可逆转此效应。

3.3 青蒿素对皮质酮诱导的细胞凋亡的影响

流式细胞术分析显示，CORT处理显著增加PC12细胞凋亡率（Annexin V⁺细胞），而青蒿素共处理可显著抑制CORT诱导的细胞凋亡。

3.4 青蒿素通过AKT和ERK信号通路发挥神经保护作用

蛋白质印迹分析表明，青蒿素处理能时间依赖性地上调PC12细胞中磷酸化AKT（p-AKT）、磷酸化ERK（p-ERK）、脑源性神经营养因子（BDNF）和磷酸化GSK3β（p-GSK3β， Ser9位点）的表达。预孵育PI3K抑制剂LY294002或MEK抑制剂PD98059，或敲低AKT1基因，均能显著阻断青蒿素对CORT诱导细胞毒性的保护作用。

3.5 青蒿素对原代海马神经元CORT诱导损伤的保护作用

在原代海马神经元中，CORT（100 μM）处理显著降低细胞活力，而青蒿素（25 μM）共处理能有效保护神经元免受CORT的毒性作用。

3.6 青蒿素改善CUMS小鼠的抑郁样行为

在CUMS小鼠模型中，青蒿素（1 mg/kg）和氟西汀治疗均能显著缩短悬尾实验（TST）和强迫游泳实验（FST）中的不动时间，并逆转CUMS引起的糖水偏好降低，表现出抗抑郁样活性。剂量反应呈倒U型，仅1 mg/kg剂量对糖水偏好有显著改善。

3.7 青蒿素激活小鼠脑内AKT/GSK/NRF2/HO1和BDNF/TrkB/ERK/CREB信号通路

蛋白质印迹分析显示，青蒿素处理能上调CUMS小鼠海马组织中p-AKT、p-GSK3β、核因子E2相关因子2（NRF2）、血红素加氧酶1（HO1）、BDNF、p-TrkB、p-ERK和p-CREB的蛋白表达水平。

3.8 青蒿素改善CUMS模型中的胶质细胞失调和神经发生损伤

免疫组化显示CUMS小鼠海马CA1区GFAP⁺星形胶质细胞活性增强，青蒿素治疗可使其恢复正常。免疫荧光显示CUMS导致NeuN⁺成熟神经元数量显著减少，青蒿素治疗能促进神经发生，恢复NeuN⁺神经元数量。

4 讨论

本研究首次系统证实了青蒿素在体外和体内模型中的神经保护和抗抑郁样作用。其作用机制涉及多条通路：在细胞水平，青蒿素通过激活AKT和ERK信号通路，减轻CORT诱导的氧化应激、线粒体功能障碍和细胞凋亡。在动物水平，青蒿素改善CUMS诱导的抑郁样行为，并伴随AKT/GSK3β/NRF2/HO1和BDNF/TrkB/ERK/CREB通路的激活、星形胶质细胞活性的调节以及海马神经发生的促进。

值得注意的是，青蒿素在疟原虫中通过铁依赖的内过氧化物桥裂解产生自由基发挥促氧化作用，而在本研究的神经元模型中却表现出抗氧化效应，这可能反映了其在不同生物学环境下的双重 redox 活性。其行为学效应的剂量反应曲线呈倒U型，这在神经药理学研究中常见。

本研究将青蒿素的已知神经保护作用与其抗抑郁潜力直接联系起来，并深入揭示了AKT和ERK信号通路在其作用中的核心地位，这与抑郁症发病机制中这些通路的关键作用相符。此外，研究还拓展了青蒿素对胶质细胞和神经发生的调节作用，为理解其多靶点抗抑郁机制提供了更全面的视角。

5 结论

青蒿素通过激活AKT和ERK信号通路，在细胞和动物抑郁模型中发挥显著的神经保护和抗抑郁样作用。其作用涉及减轻氧化损伤、改善线粒体功能、抑制凋亡、调节胶质细胞活性及促进神经发生等多重机制。这些发现表明青蒿素有望成为一种新型抗抑郁药物的候选化合物，为抑郁症的治疗提供了新的潜在策略。未来研究需进一步推动其临床转化应用。