整合单细胞转录组与全基因组CRISPR-CAS9筛选揭示三阴性乳腺癌肿瘤依赖性相关细胞亚群及其治疗意义

《Frontiers in Oncology》：Integrating single-cell transcriptomics and whole-genome CRISPR CAS9 screen identifies a cell cluster associated with tumor dependency in triple-negative breast cancer

本文通过整合全基因组CRISPR-CAS9筛选与单细胞转录组学，鉴定出三阴性乳腺癌（TNBC）中四个关键肿瘤依赖性基因（TONSL、TIMELESS、RFC3、RAD51），并发现其定义的C6上皮细胞亚群位于肿瘤细胞分化末端，与能量代谢重编程和不良预后密切相关。研究进一步通过体细胞突变分析和药物筛选，为TNBC患者提供了分层治疗策略和潜在靶向药物（如CDK抑制剂），为个性化治疗提供了新见解。

　　

引言

三阴性乳腺癌（TNBC）是乳腺癌中预后最差的亚型，由于缺乏内分泌治疗靶点，患者无法从靶向治疗或激素治疗中获益。肿瘤微环境（TME）的异质性进一步导致其高转移潜力和治疗抵抗。尽管已有研究尝试针对TME中的肿瘤相关细胞（如癌症相关成纤维细胞CAFs）寻找遗传标记和治疗策略，但TNBC的临床预后生物标志物和治疗选择仍然有限。CRISPR-Cas9系统作为一种高效的基因编辑技术，通过全基因组筛选能够系统性地鉴定肿瘤细胞生存所依赖的基因，为识别关键分子靶点提供了有力工具。本研究整合多组学数据，旨在识别TNBC中关键的肿瘤细胞亚群，作为预后标志物和潜在治疗靶点。

方法

研究利用包括单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据、批量RNA测序（bulk RNA-seq）数据、全基因组CRISPR-Cas9筛选数据和基因组测序数据在内的综合数据集。从DEPMAP数据库获取经CERES算法处理的CRISPR-Cas9筛选数据，筛选条件为平均CERES分数<-1且在至少80%的TNBC样细胞系中CERES分数<-1，以鉴定肿瘤依赖性基因（TDGs）。利用TCGA-BRCA和METABRIC队列进行表达、生存关联和通路富集分析。单细胞数据分析使用Seurat R包（v5.0.0）进行质控、整合、归一化（SCTransform）、批次校正和细胞类型注释。上皮细胞亚群通过slingshot算法进行伪时间轨迹重建。肿瘤依赖性基因特征评分（代表C6亚群富集分数）使用单样本基因集富集分析（ssGSEA）计算。体细胞突变分析使用maftools包。潜在治疗化合物通过连接性图谱（CMAP）数据库筛选。通过集落形成实验和CCK-8实验验证TONSL基因的生物学功能。

结果

通过全基因组CRISPR-CAS9筛选鉴定肿瘤依赖性基因

通过分析22个TNBC样细胞系的CRISPR-Cas9敲除数据，在严格标准下（平均CERES分数<-1且在≥80%细胞系中成立）鉴定出665个肿瘤依赖性基因。单变量Cox回归分析优先确定了28个与不良预后显著相关的基因（P < 0.05，HR > 1）。TNBC与正常组织的差异表达分析揭示了1150个上调基因（log₂FC > 0.5，adj.P < 0.05）。这些基因集的交集产生了四个高置信度的肿瘤依赖性基因：TONSL、TIMELESS、RFC3和RAD51。这些基因在TNBC中显著过表达，彼此间存在强相关性（P < 0.001），并且每个基因的高表达均预示着总生存期（OS）的降低（log-rank P < 0.01）。

肿瘤依赖性基因潜在参与细胞增殖

基因集富集分析（GSEA）显示，这些肿瘤依赖性基因的高表达富集了多种促肿瘤通路。RAD51高表达激活了细胞周期、TNFα信号通过NF-κB、上皮-间质转化（EMT）和缺氧反应等通路。RFC3高表达则富集了E2F靶标、G2/M检查点、MTORC1信号和DNA复制通路。TIMELESS高表达与细胞周期进程、E2F靶标、MYC靶标v1和EMT通路激活相关。TONSL过表达驱动了E2F靶标、G2/M检查点、有丝分裂纺锤体组装和细胞周期调控通路。这些结果表明，RAD51、TIMELESS、RFC3和TONSL共同汇聚于维持肿瘤生存和扩增的促增殖通路。

C6亚群与TNBC肿瘤依赖性高度相关

对5个TNBC样本的scRNA-seq数据整合分析，在严格质控后获得15,080个高质量细胞，注释出9种主要细胞类型。聚焦于5,412个上皮细胞进行亚群分析，鉴定出7个上皮亚群。对四个肿瘤依赖性基因进行特征评分显示，C6亚群的富集分数最高，表明C6上皮细胞表现出最强的肿瘤依赖性，可能代表了TNBC中最关键增殖和存活的区室。

C6亚群是肿瘤细胞分化的终末状态

使用slingshot算法重建上皮细胞的伪时间轨迹，揭示了两个主要的分化路径。谱系1（79.6%的细胞）起源于C1/C3亚群，经过C0/C4中间状态，最终达到C6终末状态。C6亚群的差异表达和功能富集分析显示其与线粒体生物能量学密切相关，包括线粒体ATP合成耦合的电子传输、电子传递链、氧化磷酸化、呼吸链复合物组装和NADH脱氢酶活性。同时，增殖通路如mTORC1信号和p53通路也在C6中共同富集。这表明C6表现出重编程的能量代谢与细胞周期失调相重合，提示其在驱动肿瘤生长和进展中起关键作用。

局灶体细胞突变与C6亚群浸润水平相关

整合TCGA转录组和基因组数据，分析影响C6浸润异质性的因素。以肿瘤依赖性基因特征评分作为C6富集的代理，发现高C6组和低C6组之间存在显著的体细胞突变差异：UNC5D、DMD和CASR在高C6组突变率更高，而PTEN和KMT2D突变在低C6组富集（P<0.05）。突变景观分析进一步揭示了两组间不同的共现模式，表明体细胞改变可能调节亚群丰度。

基于C6亚群丰度的精准治疗意义

利用METABRIC队列中319名TNBC患者的转录组和临床数据，通过ssGSEA量化C6富集度（肿瘤依赖性基因特征）。根据治疗史将患者分层发现，仅接受手术的高C6浸润患者总生存期显著更差（log-rank P = 0.017），而在仅放疗（P = 0.38）、仅化疗（P = 0.2）或放化疗联合（P = 0.14）的患者中，这种关联不显著。这表明单纯手术对高C6患者效果不佳，而放疗和/或化疗可能克服C6驱动的不良结局。通过CMAP平台筛选针对高C6 TNBC的潜在抑制剂，得分靠前的化合物（连接分数≤ -90）富集了CDK抑制剂，这与C6亚群的促增殖表型在机制上吻合。

TNBC细胞系中候选基因的验证

空间转录组学分析显示，TONSL、TIMELESS、RFC3和RAD51在肿瘤区域的表达显著高于肿瘤间质区域。基于单变量COX回归分析中TONSL的风险比（HR）最高，选择其进行功能验证。在MDA-MB-231细胞中敲低TONSL损害了克隆形成能力和增殖能力，证实了其在TNBC中的促增殖作用。

讨论

本研究通过CRISPR-Cas9系统鉴定了TNBC细胞中的肿瘤依赖性基因TONSL、TIMELESS、RFC3和RAD51。这些基因主要参与DNA复制和修复，表明TNBC肿瘤细胞表现出活跃的DNA复制，同时可能经历DNA错配和损伤。它们均与TNBC患者预后相关。基于此定义的肿瘤依赖性特征，高表达此特征的肿瘤细胞可能代表了一种终末分化状态，并倾向于携带更复杂的体细胞突变，表明更高的基因组不稳定性。富含这些高肿瘤依赖性细胞的患者临床结局更差。因此，通过这四个基因的表达识别该细胞群体，并利用本研究鉴定的候选药物进行靶向，可能为针对不同TNBC进展状态的个性化治疗提供有前景的策略。这些基因通过参与DNA损伤修复和激活致癌信号通路（如mTORC1、E2F、EMT）促进TNBC进展。单细胞分析揭示的C6亚群位于上皮细胞分化轨迹末端，并表现出向氧化磷酸化主导的能量代谢重编程，这可能通过增强EMT、抑制凋亡和强化干细胞特性驱动肿瘤进展。体细胞突变分析提示特定遗传改变与C6丰度相关。临床分层表明，高特征评分患者预后差，且单纯手术效果不佳，而联合放化疗可能有益。药物筛选出的CDK等通路抑制剂为个性化治疗提供了方向。研究的局限性包括筛选标准可能过滤掉特定亚型重要基因、仅验证了TONSL的功能、预测通路需实验验证、临床分层需大样本试验评估、空间转录组样本量小以及候选化合物需临床前模型验证。

结论

本研究鉴定出TONSL、TIMELESS、RFC3和RAD51作为TNBC的肿瘤依赖性基因。这些基因可能通过促进肿瘤生长和保护癌细胞免受化疗损伤，从而促进TNBC进展和不良预后。此外，由这些基因衍生的特征评分有助于根据疾病进展对TNBC患者进行分层，并为个性化治疗策略提供了潜在框架。