基于生物信息学探讨片仔癀通过EGFR/JAK1/STAT3通路抗肝纤维化的机制

《Frontiers in Immunology》：Bioinformatics based exploration of the anti-liver fibrosis mechanism of Pien Tze Huang via EGFR/JAK1/STAT3 pathway

本研究通过整合网络药理学、分子对接、分子动力学模拟及体内外实验，系统揭示了传统中药片仔癀（PZH）通过抑制巨噬细胞介导的炎症反应改善肝纤维化的新机制。研究发现PZH核心成分人参皂苷Rh2可高亲和力结合EGFR、JAK1、STAT3靶点，有效阻断EGFR/JAK1/STAT3信号通路活化，从而减轻CCL4诱导的小鼠肝纤维化病理改变、胶原沉积及M1型巨噬细胞极化。该研究为PZH临床应用提供了分子药理学依据。

　　

1 引言

肝纤维化是慢性肝病进展的关键阶段，全球约20亿人受慢性肝病影响，其中25%-30%会进展为肝纤维化。中国肝纤维化患病率达7%-12%，主要驱动因素为乙型肝炎病毒感染（占45%）和非酒精性脂肪性肝病（占30%）。当前临床抗纤维化药物如吡非尼酮和尼达尼布存在毒性大、副作用明显及单靶点局限等问题，因此从传统中药中发掘多靶点治疗方案具有重要意义。

片仔癀作为具有500余年应用历史的中药复方，具有清热解毒、活血化瘀的功效，临床研究表明其对肝纤维化具有改善作用，但具体分子机制尚未完全阐明。表皮生长因子受体（EGFR）与Janus激酶1（JAK1）形成的复合物可磷酸化信号转导与转录激活因子3（STAT3），进而调控纤维化相关基因表达。本研究通过多学科技术整合，旨在系统揭示PZH抗肝纤维化的作用靶点与信号通路机制。

2 材料与方法

2.1 实验动物与模型构建

采用40只C57BL/6雄性小鼠，通过腹腔注射四氯化碳（CCL₄）/花生油溶液（1:9, v/v）连续6周诱导肝纤维化模型。设空白对照组、模型对照组及PZH低（0.117 g/kg/d）、中（0.234 g/kg/d）、高（0.468 g/kg/d）剂量组，灌胃给药6周。

2.2 网络药理学分析

通过TCMSP、TCMID等数据库筛选PZH的24种活性成分（包括人参皂苷Rh2、槲皮素、熊果酸等），利用Swiss Target Prediction平台预测靶点，与Genecards、OMIM数据库中的肝纤维化靶点取交集，获得196个共同靶点。采用Cytoscape构建蛋白互作（PPI）网络，筛选出AKT1、IL6、TNF、EGFR、STAT3等20个核心靶点。通过GO和KEGG富集分析显示这些靶点显著富集于癌症通路、细胞因子信号通路等，其中EGFR/JAK1/STAT3通路与肝纤维化密切相关。

2.3 分子对接与动力学模拟

利用AutoDock软件进行人参皂苷Rh2与EGFR（PDB: 1M14）、JAK1（PDB: 6SM8）、STAT3（PDB: 6NJS）的分子对接，结合能分别为-8.042、-9.444和-8.085 kcal/mol。通过GROMACS进行100 ns分子动力学模拟，结果显示复合物RMSD值稳定在0.2 nm范围内，氢键数量保持稳定（平均0.756-1.526个），MM/PBSA计算结合自由能分别为-21.78、-23.74和-28.30 kcal/mol，证实结合稳定性。

2.4 细胞实验

以LPS诱导RAW264.7巨噬细胞建立炎症模型，设空白对照组、LPS模型组、PZH低中高剂量组（50、75、100 μg/mL）及人参皂苷Rh2低中高剂量组（2、4、6 μg/mL）。通过Griess法检测一氧化氮（NO）水平，ELISA法检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）含量，Western blot检测EGFR、p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3蛋白表达。

3 结果

3.1 PZH改善肝纤维化病理指标

与模型组相比，PZH各剂量组显著降低血清谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、III型前胶原（PC-III）和IV型胶原（C-IV）水平（P < 0.01）。肝组织H&E和Masson染色显示PZH剂量依赖性减轻肝细胞气球样变、炎性浸润及胶原沉积，高剂量组肝脏形态接近正常。

3.2 PZH抑制巨噬细胞M1极化

体内实验显示PZH降低血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平（P < 0.01），免疫组化及Western blot证实PZH下调CD68、IRF5、IL-12A表达。体外实验中，PZH和人参皂苷Rh2均能抑制LPS诱导的NO、TNF-α、IL-6、IL-1β释放（P < 0.01），并降低IRF5核转位，表明其通过抑制M1极化发挥抗炎作用。

3.3 PZH调控EGFR/JAK1/STAT3通路

网络药理学预测EGFR/JAK1/STAT3为PZH作用核心通路。Western blot结果显示PZH和人参皂苷Rh2显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞及CCL₄诱导的肝组织中EGFR、p-JAK1、p-STAT3蛋白表达（P < 0.01），验证了该通路的调控作用。

4 讨论

本研究首次通过多维度技术策略揭示PZH抗肝纤维化的新机制。网络药理学筛选出人参皂苷Rh2等关键成分，分子对接及动力学模拟证实其与EGFR、JAK1、STAT3的稳定结合。实验验证表明PZH通过阻断EGFR/JAK1/STAT3信号轴，抑制巨噬细胞向M1表型极化，减少促炎因子释放，从而缓解肝纤维化进程。该发现不仅阐明PZH的多靶点作用特性，也为中药复方机制研究提供了“计算-实验”协同的研究范式。

5 结论

片仔癀通过人参皂苷Rh2等活性成分靶向抑制EGFR/JAK1/STAT3信号通路，阻断巨噬细胞M1极化及炎症反应，从而发挥抗肝纤维化作用。该研究为PZH的临床转化提供了理论依据，并为中药复方系统药理学研究提供了方法论参考。