干细胞源性肝窦内皮细胞：一种用于研究肝窦内皮细胞形态和区域特性的新型体外模型

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Aspects of zone-like identity and holotomographic tracking of human stem cell-derived liver sinusoidal endothelial cells

本研究成功从人多能干细胞分化获得肝窦内皮细胞样细胞（scLSEC），证实其具备LSEC关键分子标志物表达和清道夫功能。创新性应用全息断层扫描技术（HT）无标记动态追踪scLSEC中类孔状亚细胞结构，并首次尝试通过区域特异性培养条件诱导门静脉周围区（Z1）和中央静脉周围区（Z3）表型，为肝脏区域化研究和疾病建模提供了新平台。

　　

干细胞源性肝窦内皮细胞的表征与功能验证

通过改良已发表的分化方案，研究团队从人胚胎干细胞系WAe001-A（H1）和人诱导多能干细胞系UCSFi001-A（WTC11）成功获得了干细胞源性肝窦内皮细胞样细胞（scLSEC）。分化流程包括中胚层诱导、内皮粗细胞扩增、LSEC特化以及分化后培养等关键阶段。经过5天的分化后培养，将获得的两个scLSEC细胞系（scLSEC_1和scLSEC_2）与商品化的原代肝窦内皮细胞（cphLSEC）以及人脐静脉内皮细胞（HUVEC）进行了系统比较。

分子表征显示，scLSEC高表达LSEC的关键标志物。在转录水平，LSEC关键转录因子c-Maf（MAF）、淋巴管内皮透明质酸受体1（LYVE1）、凝血因子VIII（F8）以及质膜囊泡相关蛋白（PLVAP）的表达水平与cphLSEC相当，并显著高于HUVEC。免疫荧光染色进一步在蛋白水平证实了LYVE1在scLSEC和cphLSEC中的表达，而在HUVEC中则检测不到。

功能分析表明，scLSEC具备LSEC的典型功能特征。一氧化氮（NO）分泌实验显示scLSEC具有分泌活性。清道夫功能评估通过流式细胞术进行，scLSEC能够有效内吞荧光标记的乙酰化低密度脂蛋白（AcLDL）并结合大肠杆菌生物颗粒，证明了其活跃的内吞能力。扫描电子显微镜（SEM）成像在scLSEC和cphLSEC表面均观察到散布的类孔状结构，但这些结构并未形成典型的筛板状聚集，因此不能定义为成熟LSEC的窗孔。

能量代谢特征分析揭示scLSEC与cphLSEC存在差异。利用放射性标记底物氧化实验评估了细胞对葡萄糖和油酸（OA）的代谢。结果显示，scLSEC与cphLSEC的葡萄糖代谢相似，但scLSEC对OA的摄取和储存更高，而氧化效率却更低，表明scLSEC对OA产能的依赖性较低，反映了其相对不成熟的状态。

全息断层扫描技术揭示scLSEC亚细胞结构动态

全息断层扫描（HT）作为一种基于折射率（RI）测量的干涉成像技术，能够无标记、活细胞、三维地可视化亚细胞结构。研究利用HT对scLSEC、cphLSEC、HUVEC以及作为非内皮对照的干细胞源性肝星状细胞（scHSC）进行了成像比较。

研究发现，在scLSEC和cphLSEC中存在大量圆形、折射率低于细胞质、与背景RI值相当的“低RI”结构，其数量和分布显著多于HUVEC。scHSC则未见此类结构，但富含表征性的高RI脂滴。Z轴堆叠的正交重建显示，相当一部分低RI结构贯穿整个细胞厚度。这些结构的形态和大小与SEM观察到的凹陷相似，尽管直接面积比较存在差异，可能源于样品制备和图像分析方法的不同。

为探究低RI结构的性质，研究进行了HT与活细胞荧光成像的关联分析。Alexa-488标记的AcLDL信号主要与HT图像中高RI的囊泡状结构（如内体或溶酶体）共定位，而非低RI结构。此外，内吞或自噬通路标志物（如LC3B、Rab7、LAMP1）也未显示在低RI结构区域有高丰度或特异性定位，排除了这些结构是典型细胞内囊泡的可能性。因此，这些低RI结构被描述为“类孔状”结构。虽然它们未聚集成筛板，不符合体内成熟LSEC窗孔的定义，但其高丰度可能与非连续表型的未成熟LSEC中存在的跨内皮通道（TECs）相对应。这与PLVAP和 Caveolin 1的阳性染色结果相符，这两种蛋白是未成熟LSEC中窗孔、小窝和TECs等跨细胞结构的关键组分。

研究进一步开发了基于随机森林分类器的机器学习算法，用于自动识别和量化HT图像中的类孔状结构。利用该工具，团队动态追踪了scLSEC在整个分化培养过程中类孔状结构的变化。结果表明，在粗细胞扩增阶段，类孔状结构的数量增加；在LSEC特化阶段，数量逐渐减少；在分化后培养阶段则保持相对稳定，但存在细胞系依赖的波动。这提示培养处理能够影响细胞的类孔状结构，表明LSEC表型与这些结构之间存在关联。

探索scLSEC区域特异性表型的诱导

肝脏区域化是沿门静脉-中央静脉轴形成的空间异质性现象。LSEC被报道在门静脉周围区（Z1）和中央静脉周围区（Z3）具有不同的身份特征。研究尝试通过模拟Z1和Z3微环境的培养条件，在体外诱导scLSEC的区域特异性表型。

研究测试了多种培养添加剂的组合，最终选取了最具潜力的条件：Z1诱导培养基添加了胰高血糖素和Wnt通路抑制剂C-59；Z3诱导培养基添加了Notch通路抑制剂DAPT以及Wnt信号蛋白Wnt2和R-Spondin 3。以未处理的scLSEC作为对照。

基因表达分析显示，Z1处理在两种scLSEC系中均引起了Z1标志物（如DLL4, EFNB2, LTBP4, NTN4, MSR1）表达上调的整体趋势，而Z3处理则倾向于下调这些标志物的表达，尤其在scLSEC_2中更为明显。然而，Z3标志物（如THBD, CDH13, KIT, RSPO3）对处理的反应方向性不明显。常见的LSEC标志物表达基本不受处理影响。

HT形态学分析未发现处理组间存在统计学显著的类孔状结构数量差异，但在scLSEC_2中观察到Z3处理组类孔状结构数量增多、尺寸减小（p = 0.08）的趋势，这与Z3表型的特征更为接近。

代谢功能分析揭示了区域特异性变化。Z3处理的scLSEC_2表现出更高的葡萄糖摄取和氧化，这与Z3区糖酵解活跃的特征相符。相反，两种scLSEC系在Z3处理下均显示出比Z1处理更低的OA摄取、细胞关联OA和OA氧化。特别是在scLSEC_2中，Z3处理还导致了OA分数氧化的降低，表明摄取的OA被氧化的比例减少，这进一步支持了Z3处理诱导了不同于Z1的代谢模式。

总结与展望

本研究证实，干细胞源性的肝窦内皮细胞（scLSEC）是体外LSEC研究的可行模型，它们表达了关键LSEC标志物并具备清道夫功能。创新性地应用全息断层扫描技术，实现了对scLSEC中类孔状亚细胞结构的无标记、动态追踪，为研究LSEC超微结构提供了新工具。初步的区域特异性诱导实验表明，通过调控培养微环境，可以在scLSEC中诱导出部分区域相关的分子和代谢特征，为深入研究肝脏区域化机制奠定了基础。

尽管scLSEC在脂肪酸代谢等方面仍显示出与成熟cphLSEC的差异，反映了其相对未成熟的状态，但通过优化培养策略（如引入3D培养、流体剪切力、更适宜的细胞外基质以及与其他肝脏细胞共培养），有望进一步推动其成熟和功能完善。未来利用诸如微生理系统等更复杂的培养平台，整合多种肝脏细胞类型、生化因子梯度和机械刺激，将能更好地模拟肝窦微环境，从而获得更具生理相关性的、具备明确区域身份的scLSEC模型，服务于肝脏生物学研究、疾病建模和药物筛选。