α-酮戊二酸通过抗氧化和抗炎机制改善糖尿病小鼠内皮祖细胞功能并促进缺血后血管新生

《Frontiers in Pharmacology》：Alpha-ketoglutarate rescues impaired endothelial progenitor cell-mediated angiogenesis in diabetic mice

本研究揭示了α-酮戊二酸（AKG）通过上调锰超氧化物歧化酶（MnSOD）和铜锌超氧化物歧化酶（CuZnSOD）表达、降低细胞内超氧阴离子（O2·-）水平，并抑制Toll样受体4（TLR4）/核因子κB（NF-κB）通路介导的炎症反应，显著改善糖尿病小鼠内皮祖细胞（EPCs）功能，促进脑缺血后血管新生，为糖尿病缺血性疾病的防治提供了新策略。

　　

1 引言

糖尿病全球患病率持续上升，心血管疾病已成为糖尿病患者主要死因。尽管强化降糖治疗未能显著降低心血管事件风险，开发防治糖尿病心血管并发症的新策略仍具重要临床意义。糖尿病心血管并发症常与内皮祖细胞（EPCs）功能障碍及缺血应答性血管新生减少相关。EPCs作为成熟内皮细胞前体，通过向血管损伤部位迁移形成新生血管参与内皮修复。因此，改善EPCs功能可能成为预防糖尿病心血管并发症的潜在策略。

α-酮戊二酸（AKG）作为三羧酸循环关键中间体，在代谢过程和膳食补充中发挥重要作用。研究表明AKG具有抗氧化和抗炎等多种药理效应。糖尿病状态下过度产生的氧化应激和炎症可能损害EPCs功能，基于此，本研究提出假说：AKG可能通过挽救糖尿病小鼠受损的EPCs介导的血管新生，成为预防缺血性疾病的安全有效选择。

2 材料与方法

2.1 糖尿病动物模型与AKG处理

采用10-12周龄雄性C57BL/6小鼠，通过连续5天腹腔注射链脲佐菌素（STZ，60 mg·kg^?1·d^?1）诱导糖尿病。血糖水平>11.1 mmol/L视为糖尿病成模。糖尿病小鼠随机分为两组，分别每日灌胃AKG（4 g·kg^?1·d^?1）或等量生理盐水，连续4周。

2.2 脑卒中动物模型

通过永久性大脑中动脉闭塞术诱导局灶性脑缺血。手术过程中维持体温37°C±0.5°C。术后3天进行行为学评估（身体不对称测试和横梁行走测试），随后取脑测定梗死体积。

2.3 神经行为学分析

身体不对称测试通过悬尾记录头部摆动方向，计算对侧摆动频率。横梁行走测试评估运动协调和平衡能力，记录穿越中央80%横梁的潜伏期。

2.4 骨髓源性EPCs的分离、培养与鉴定

从小鼠胫骨和股骨分离骨髓单个核细胞，接种于大鼠玻连蛋白包被的培养板，使用内皮生长培养基-2（EGM-2）培养。通过流式细胞术检测Sca-1和Flk-1共表达，并通过Dil-acLDL/凝集素/Hoechst三重染色鉴定EPCs。

2.5 功能学实验

采用粘附实验、迁移实验和小管形成实验评估EPCs功能。超氧阴离子水平使用二氢乙啶（DHE）荧光探针通过流式细胞术检测。

2.6 细胞移植与动物模型

脑缺血后立即通过尾静脉注射1×10⁶个EPCs，评估其对脑缺血损伤和血管新生的影响。

2.7 人脐静脉内皮细胞实验

HUVECs培养于RPMI 1640培养基，使用高葡萄糖（33 mM）模拟糖尿病条件，评估AKG对细胞功能、氧化应激和炎症的影响。

2.8 蛋白质印迹分析

检测MnSOD、CuZnSOD、TLR4、NF-κB、IL-6、IL-1β等蛋白表达水平。

2.9 药理学干预

使用TLR4拮抗剂（CLI-095、MD2-TLR4-IN-1）和NF-κB抑制剂（JSH-23）探讨信号通路机制。

2.10 统计分析

数据以均值±标准误表示，多组比较采用单因素方差分析和Newman-Keuls事后检验。

3 结果

3.1 AKG对糖尿病小鼠空腹血糖和体重的影响

STZ注射显著增加空腹血糖水平并降低体重。4周AKG治疗对糖尿病小鼠空腹血糖水平和体重无显著影响。

3.2 AKG治疗保护糖尿病小鼠抵抗脑缺血损伤

糖尿病小鼠脑缺血损伤更严重，梗死体积增加28.3%。AKG治疗显著减少梗死体积（41.4%）并改善神经功能缺损。

3.3 AKG治疗促进糖尿病小鼠缺血脑区血管新生

糖尿病小鼠缺血边界区CD31⁺微血管数量减少37.2%，vWF⁺微血管减少46.5%。AKG治疗显著增加CD31⁺（38.3%）和vWF⁺（42.9%）微血管数量。

3.4 AKG治疗挽救糖尿病小鼠BM-EPCs功能障碍

糖尿病BM-EPCs粘附、迁移和小管形成功能显著受损。AKG治疗显著改善这些功能异常。

3.5 AKG对BM-EPCs中MnSOD、CuZnSOD和细胞内O₂^·-表达水平的影响

糖尿病BM-EPCs中MnSOD和CuZnSOD表达分别降低19.2%和28.1%，细胞内O₂^·-水平增加48.4%。AKG治疗显著增加SOD表达并降低O₂^·-水平。

3.6 AKG对BM-EPCs中TLR4、NF-κB、IL-6和IL-1β表达水平的影响

糖尿病BM-EPCs中TLR4、NF-κB、IL-6和IL-1β表达显著升高。AKG治疗显著降低这些炎症因子表达。

3.7 AKG增强糖尿病BM-EPCs对脑缺血损伤的治疗作用

移植AKG处理的糖尿病EPCs显示更强的促进血管新生和减少脑缺血损伤的能力，较未处理糖尿病EPCs效果显著改善。

3.8 AKG对HUVECs活力的影响

0.05-8 mM AKG处理24小时对HUVECs活力无影响，选择0.5 mM进行后续功能研究。

3.9 AKG逆转高葡萄糖诱导的HUVECs功能障碍

高葡萄糖显著损害HUVECs粘附和迁移功能，0.5 mM AKG处理显著改善这些功能异常。

3.10 AKG增加高葡萄糖暴露的HUVECs中MnSOD和CuZnSOD水平

高葡萄糖降低MnSOD和CuZnSOD表达，增加细胞内O₂^·-水平。AKG处理显著逆转这些变化。

3.11 AKG通过TLR4信号通路抑制HUVECs中促炎细胞因子产生

AKG抑制高葡萄糖诱导的TLR4、NF-κB、p-NF-κB、IL-6、TNF-α和IL-1β过表达。TLR4信号抑制剂消除AKG对粘附功能的改善作用。

3.12 AKG通过NF-κB信号通路抑制HUVECs中促炎细胞因子产生

AKG抑制高葡萄糖诱导的p-NF-κB、IL-1β、IL-6和TNF-α表达。NF-κB抑制剂消除AKG对炎症的抑制作用。

4 讨论

本研究主要发现：AKG通过改善EPCs功能促进缺血脑区血管新生，保护糖尿病小鼠抵抗脑缺血损伤；AKG治疗增加MnSOD和CuZnSOD表达，降低细胞内O₂^·-水平；AKG降低糖尿病EPCs中TLR4、NF-κB、IL-6和IL-1β等促炎因子表达；AKG通过TLR4/NF-κB通路减轻高葡萄糖诱导的HUVECs炎症反应和氧化应激。

研究表明，AKG长期作为运动员营养补充剂，安全性已得到验证。静脉注射鸟氨酸AKG（连续5天每天25 g）显著改善近期脑卒中患者神经功能恢复。根据小鼠与人类表面积换算比例（9.1），小鼠AKG日剂量为4 g/kg，与本研究使用剂量一致。

糖尿病通过氧化应激、白细胞功能异常、血管新生异常、血脑屏障通透性增加和炎症反应等多种有害途径加重脑血管疾病后损伤。血管新生是脑缺血后血管损伤修复的基本过程。EPCs作为内皮细胞重要前体，参与血管形成，并成功用于缺血脑区内皮功能恢复和血管新生能力增强。本研究首次发现AKG治疗显著改善EPC功能，增强缺血脑区血管新生，减少糖尿病小鼠脑缺血损伤。

分子机制上，MnSOD和CuZnSOD关键调控EPC功能。细胞内O₂^·-增加是糖尿病和高血压小鼠EPC功能障碍的主要机制。SODs是针对O₂^·-的主要抗氧化防御系统。因此，AKG治疗增加MnSOD和CuZnSOD水平并降低细胞内O₂^·-水平，可能部分促进AKG处理的糖尿病小鼠EPC功能。

TLR4介导的内皮炎症反应参与糖尿病相关动脉粥样硬化进展。促炎细胞因子和粘附分子的诱导表达是内皮促炎激活的关键步骤和标志。NF-κB是ECs及其他细胞中促炎反应的主要调节因子。近期研究表明AKG具有抗炎作用。本研究证明TLR4、NF-κB、IL-6和IL-1β表达水平在糖尿病EPCs中显著增加，AKG处理可降低这些炎症因子表达。因此，AKG可能通过TLR4/NF-κB信号通路下调炎症，减轻糖尿病EPCs损伤。

在HUVECs实验中，AKG显著抑制高葡萄糖诱导的TLR4、p-NF-κB、NF-κB、IL-6、TNF-α和IL-1β过表达。TLR4或NF-κB抑制剂减弱AKG对高葡萄糖孵育HUVECs炎症的抑制作用和对粘附功能的改善作用。这些结果表明TLR4/NF-κB信号通路可能参与AKG抑制高葡萄糖诱导的HUVECs炎症的机制。

综上所述，本研究证明AKG可预防糖尿病小鼠脑缺血损伤，这部分归因于改善EPCs介导的缺血脑区血管新生。这一结果提示AKG治疗可能是预防糖尿病缺血性疾病（包括脑卒中）的安全有效方式。