猪背最长肌miRNA-mRNA互作研究：品种特异性调控网络的多组学鉴定与功能验证

《Frontiers in Animal Science》：miRNA-mRNA crosstalk in porcine longissimus dorsi muscle: multi-omics identification of breed-specific regulatory networks and functional verification

本研究通过转录组测序分析霍寿黑猪与约克夏猪背最长肌组织，鉴定出2833个差异表达基因（DEGs）和51个差异表达miRNA（DEMs），发现DEGs显著富集于MAPK、AMPK等与肌内脂肪（IMF）沉积相关的代谢通路。通过构建miRNA-mRNA互作网络，筛选出miR-205等9个关键miRNA，并利用双荧光素酶报告实验验证了miR-205对MYH7B的靶向调控作用，为解析中西方猪种IMF差异的分子机制提供了新视角。

　　

1 引言

猪肉作为中国主要的动物蛋白来源，其品质直接影响消费者偏好。肌内脂肪（IMF）含量是评价猪肉品质的关键指标。霍寿黑猪（HS）作为地方脂用型猪种具有高IMF含量但生长缓慢，而约克夏猪（YY）作为引进瘦肉型猪种生长快但IMF含量低，二者为研究IMF沉积的分子机制提供了理想模型。微RNA（miRNA）通过靶向mRNA的3'非翻译区（3' UTR）调控基因表达，已有研究表明miR-23a、miR-29a等可通过影响MEF2C、COL3A1等靶基因参与肉品质调控，但中西方猪种背最长肌中miRNA的调控网络尚不明确。

2 材料与方法

2.1 实验动物与样本采集

选取3头去势成年雄性HS猪和3头YY猪，在相同饲养条件下屠宰后采集第3-4肋间背最长肌组织，部分液氮速冻用于测序，部分4%多聚甲醛固定用于组织学分析。

2.2 组织学分析

通过苏木精-伊红（H&E）染色观察肌肉形态，发现HS猪肌纤维呈椭圆形、直径较小且间隙较宽，YY猪肌纤维呈不规则方形、直径较大且排列紧密，定量分析显示HS猪肌纤维直径显著小于YY猪。

2.3 转录组测序与分析

RNA提取后构建文库进行测序，使用Hisat2将clean reads比对至猪参考基因组（Sscrofa 11.1），通过DESeq2以|Log₂FC|≥0.58且FDR<0.05为标准鉴定DEGs。

2.4 miRNA测序与分析

利用miRDeep2进行miRNA鉴定和定量，DEMs筛选标准与DEGs一致，通过miRanda预测DEMs靶基因。

2.5 功能富集分析

使用ClusterProfiler进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，以P<0.05为显著阈值。

2.6 miRNA-mRNA网络构建

将DEMs靶基因与DEGs取交集，基于miRNA负调控原则筛选互作对，使用Cytoscape可视化网络。

2.7 qRT-PCR验证

随机选择4个DEGs和4个DEMs进行qRT-PCR，以GAPDH和U6为内参，结果与测序数据一致。

2.8 双荧光素酶报告实验

将MYH7B的3' UTR野生型（WT）和突变型（MUT）序列克隆至psiCHECK2载体，与miR-205 mimic共转染HEK293T细胞，检测荧光素酶活性变化。

3 结果

3.1 肌肉组织形态

H&E染色证实HS猪肌纤维直径显著小于YY猪，与其高IMF特征相符。

3.2 测序数据质量

mRNA和miRNA文库的比对率分别达94.5%-97.1%和80%以上，Pearson相关性R2>0.99（mRNA）和>0.80（miRNA），表明数据可靠。

3.3 差异表达分析

共鉴定2833个DEGs（1559个上调，1274个下调）和51个DEMs（14个上调，37个下调）。火山图显示关键基因（如MYH7B、FASN）和miRNA（如miR-29b、miR-10a-5p）的表达差异。

3.4 DEGs功能富集

GO分析显示DEGs显著富集于脂质代谢、细胞外基质等生物学过程。KEGG分析提示DEGs主要参与MAPK信号通路、AMPK信号通路和脂肪酸生物合成通路，其中MAPK14、LEP等基因表达在HS猪中显著上调。

3.5 DEMs靶基因富集

DEMs靶基因富集于不饱和脂肪酸生物合成、PI3K-Akt信号通路等，miR-10a-5p、miR-29b等关键miRNA与脂质稳态相关。

3.6 网络构建与通路分析

筛选170个差异表达靶基因（DETGs），构建包含194节点、173边的互作网络。靶基因显著富集于细胞外基质-受体相互作用、apelin信号通路等。

3.7 双荧光素酶验证

miR-205 mimic显著抑制MYH7B-3' UTR-WT组的荧光素酶活性（P<0.01），而MUT组无变化，证实MYH7B为miR-205直接靶标。

4 讨论

4.1 肌肉形态与IMF关联

HS猪较小的肌纤维直径和较宽间隙与其高IMF含量一致，符合脂用型猪种特征。

4.2 关键通路调控作用

MAPK通路中MAPK14、MAPKAPK2等基因在HS猪高表达，可能通过促进脂肪生成和肌发育增强IMF沉积。AMPK通路中LEP上调可能激活脂肪酸氧化调控。脂肪酸生物合成通路中FASN、ACSL1等基因的差异表达直接影响脂质合成效率。

4.3 miRNA的协同调控

网络分析揭示miR-10a-5p通过抑制COL6A1和CROT促进脂沉积，miR-122-5p靶向ELOVL6调控脂肪细胞分化，miR-127通过FN1抑制脂滴积累，而miR-205对MYH7B的靶向抑制可能影响肌纤维类型转化与脂代谢平衡。

5 结论

本研究通过多组学整合分析揭示了HS与YY猪背最长肌中miRNA-mRNA互作网络的品种特异性差异，筛选出9个关键miRNA（如miR-205、miR-29b等）及其调控的MAPK、AMPK等通路，为分子育种改善猪肉品质提供了理论依据和候选靶点。