血清25-羟基维生素D水平反映犬慢性肠病的临床特征及预后意义

《Frontiers in Veterinary Science》：Serum 25(OH)D reflects clinical characterization in dogs with chronic enteropathies

本综述聚焦于犬慢性肠病（CE）中血清25-羟基维生素D（25(OH)D）水平与临床表型及治疗反应的关系。研究表明，25(OH)D水平在食物反应性肠病（FRE）、微生物群调节反应性肠病（MrMRE）、免疫抑制反应性肠病（IRE）及蛋白丢失性肠病（PLE）组间存在显著差异，尤其在PLE和IRE犬中显著降低。多变量线性回归模型揭示，果糖胺（Fructosamine）和磷（Phosphorus）与25(OH)D呈正相关，而C反应蛋白（CRP）升高则与较低的25(OH)D相关。结论指出，25(OH)D受炎症负向影响，并反映了CE犬临床特征的严重程度及血清蛋白相关生物标志物状态，提示其作为疾病严重程度评估指标的潜力。

　　

引言

慢性肠病（CE）是犬类中一组常见的异质性胃肠道疾病，其特征是持续或反复出现的胃肠道症状，最常见的有腹泻、呕吐、食欲不振和体重减轻。CE包含多种临床表型，传统上根据犬对旨在实现临床缓解的阶梯式治疗方法的反应进行分类。并发蛋白丢失性肠病（PLE）的病例被认为是最严重的，并且与较差的预后相关。维生素D水平低下在患有慢性肠道疾病的犬中很常见。它与CE和PLE的疾病严重程度增加、CE中炎症标志物升高、更差的组织病理学评分以及CE和PLE中较差的结局相关。

CE中维生素D缺乏症的发生可能是多因素的，涉及几个尚未在犬中得到彻底研究的相互关联的途径。由于肠道炎症和粘膜损伤导致的脂肪和脂溶性维生素吸收受损是一个主要因素，这得到了患病犬血清胆固醇和α-生育酚降低的支持。全身性和胃肠道炎症可能进一步损害维生素D状态。此外，低白蛋白血症可能会降低维生素D的转运能力，尽管维生素D结合蛋白的直接丢失似乎不那么重要。继发性紊乱如甲状旁腺功能亢进和低钙血症，以及炎症细胞因子的潜在影响和维生素D受体表达的改变也可能起作用，而饮食摄入减少尚未被一致证明是主要原因。

尽管维生素D在CE中的重要性已得到认可，但其测量并非常规进行。虽然其与犬慢性肠病临床活动指数（CCECAI）评分的相关性已被描述，但维生素D状态与基于治疗反应的临床表型之间的潜在关联尚未有报道。本研究假设，根据维生素D的预测潜力，维生素D浓度的差异将与临床症状严重程度和治疗反应的变化相关。为了验证这一理论，对一组诊断为CE且有记录治疗反应的犬进行了一项回顾性研究，测量了其血清25-羟基维生素D（25(OH)D）浓度。为了研究维生素D水平与其他血液参数之间的可能关联，还评估了这些犬患者数据库中可用的实验室检测结果。

材料与方法

本研究回顾性纳入了诊断为CE的成年犬，这些犬在2021年5月至2023年4月期间在博洛尼亚大学兽医教学医院接受了首次临床检查和血液采样。从医疗记录中获取的数据包括信号、病史、全面的诊断评估、临床和临床病理学发现以及随时间重新评估的随访检查。出于研究目的，从医疗记录中提取了以下数据：体重、体况评分（BCS，采用9分制）、粪便评分（FS，基于7分制的普瑞纳粪便评分表）和犬炎症性肠病活动指数（CIBDAI），包括总分和个体参数（活动度、食欲、呕吐、体重减轻、粪便稠度和排便频率）。如果犬在检查时满足以下条件，则符合研究的纳入标准：1）表现出与慢性肠病一致的临床症状（主要是呕吐、腹泻或两者皆有）超过3周；2）进行了实验室检测，包括全血细胞计数（CBC）、全面的血清化学分析（包括果糖胺和血清总钙）以及尿检（含尿蛋白：肌酐比值）；3）未接受任何已知影响钙代谢的膳食补充剂或药物（例如，碳酸钙、维生素D、糖皮质激素），因此其钙摄入仅来自其习惯饮食。排除标准包括：研究方案定义的不完整数据集；并发疾病的证据（包括蛋白丢失性肾病、慢性肾病、糖尿病、急性胰腺炎、胰腺外分泌功能不全、尿石症和尿路感染）。排除的原因还包括：关于特定产品或至少类别（例如，含有水解蛋白的商业日粮、高消化性日粮、新型蛋白日粮）的信息模糊或不精确，以及饲喂不平衡的家庭自制日粮。

根据诊断CE后后续随访中记录的信息，将犬分为四个主要类别：食物反应性肠病（FRE），定义为对作为初始治疗方法的提议的一种或多种饮食试验有积极反应；微生物群相关调节反应性肠病（MrMRE），指对至少2次饮食试验未完全反应，但在接受益生菌和/或粪便微生物群移植（作为饮食试验的辅助疗法）后表现出临床改善的犬；免疫抑制反应性肠病（IRE），定义为对糖皮质激素（泼尼松龙）和/或其他免疫抑制剂（环孢素）有积极反应，这些药物是在对饮食和/或微生物靶向治疗缺乏临床反应后引入的。一部分犬有低白蛋白血症证据（白蛋白 < 2.75 g/dL，总蛋白 < 5.60 g/dL），且尿检未检测到蛋白尿，或无其他表明蛋白质通过非肠道途径丢失的临床病理学发现（如肝功能不全），则被归类为患有PLE。

研究中包含的犬的血清样本通过使用真空系统进行静脉采血获得。样本是在进行临床评估时收集的，该评估旨在调查慢性胃肠道症状。用于血液采样的静脉包括颈静脉、头静脉或隐静脉。血样在专用的血清分离管中凝集，然后在3000×g下离心10分钟。将所得血清立即转移到塑料管中，并储存在兽医教学医院临床实验室的-20°C环境下，在25(OH)D分析前的储存时间长达24个月。所有血液分析均在转诊机构的医学实验室使用标准实验室方法进行；全血细胞计数使用自动化血液分析仪进行，而化学参数则在自动化化学分析仪上进行。血清果糖胺分析使用比色硝基蓝四唑还原法进行。

25(OH)D的定量分析使用经过验证的超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）分析方法对储存的血清样本进行。该方法的定量下限为10 ng/mL。此前已在40只健康犬群中进行了25(OH)D的定量，其范围在13至45 ng/mL之间。健康犬，主要是进行年度检查的献血犬，在本研究中被用作对照组。

统计分

所有数据均使用标准描述性统计进行描述，并以中位数和范围（最小值和最大值）或平均值±标准差（分别针对非正态分布和正态分布）报告。连续变量的正态性使用D'Agostino-Pearson检验进行评估。使用ANOVA或Kruskal-Wallis检验（取决于数据分布）比较临床分类组之间的年龄、体重、BCS、CIBDAI、FS和血清25(OH)D。当检测到显著差异时，进行适当的^事后分析（Tukey检验或Dunn检验）。最初进行单变量线性回归以探索25(OH)D与以下个体变量之间的关联：年龄（月）、BCS、FS和CIBDAI评分；血细胞比容（Hct）、白细胞计数（中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞）和血小板计数；果糖胺、总胆红素、总蛋白、白蛋白、胆固醇、甘油三酯、肌酐、尿素、总钙、磷酸盐、钠、钾、氯化物、C反应蛋白（CRP）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）的浓度。将显示潜在关联（P < 0.05）的变量使用向后选择法输入多变量线性回归模型，如果p值 > 0.20，则从模型中移除因素。使用决定系数（R²）、调整后R²、残差标准差和方差膨胀因子来评估模型性能和多重共线性。计算标准化回归系数（β）以便于图形比较效应大小，从而能够解释每个预测变量对25(OH)D的相对影响。显著性设定为p < 0.05。使用GraphPad Prism版本9.2和MedCalc统计软件进行统计分析。

结果

共有91只犬符合纳入标准，按类别分布如下：n = 39（43%）FRE，n = 26（28%）MrMRE，n = 16（18%）IRE，n = 10（11%）PLE。对医疗记录的评估允许在入组时对每组犬进行更详细的表征。犬被分类为FRE是基于对一次（n = 9）、两次（n = 23）或三次（n = 7）饮食试验的积极反应。临床症状通过以下饮食得到缓解：水解蛋白饮食（n = 17）、自制饮食（n = 14）、胃肠道饮食（n = 4）和新型蛋白饮食（n = 4）。在MrMRE组中，17只犬在接受益生菌治疗后显示临床缓解，而9只接受了粪便微生物群移植。在IRE组中，12只犬单独接受泼尼松龙治疗，4只接受泼尼松龙和环孢素的组合治疗。诊断为PLE的犬采用低脂饮食和以下一种治疗方法进行管理：泼尼松龙（n = 7）；泼尼松龙和环孢素的组合（n = 2）；或低脂饮食联合氯吡格雷，不使用免疫抑制剂（n = 1）。大多数是纯种犬（66/91, 72%），总共有32个不同品种。按类别分类时，混种犬在FRE、MrMRE和PLE组中占比最高，分别占病例的26%（10/39）、31%（8/26）和30%（3/10）。在IRE组中，德国牧羊犬和混种犬的代表性相等，各占病例的25%（4/16）。在总人群中，59%（54/91）的犬是雄性（n = 39只未绝育，n = 15只已绝育）。除PLE组外（雌性占病例的60%（6/10），其中n = 5只已绝育，n = 1只未绝育），所有类别中均观察到类似的雄性优势。

比较不同类别之间的年龄（月）、体重（kg）、BCS、CIBDAI和FS数据。组间年龄存在显著差异（p = 0.006），FRE组的犬比PLE组的犬更年轻[中位数40个月（11-168）对比115个月（26-164）；p = 0.019]。FRE组与其他组之间在年龄上未发现显著差异。CIBDAI评分在组间也存在显著差异（p = 0.003），PLE犬显示出比FRE[中位数4（0-10）；p = 0.04]和MrMRE[中位数4（1-8）；p = 0.049]更高的值[中位数8（2-15）]。在体重、BCS或FS方面未发现显著差异。

血清25(OH)D浓度在组间存在显著差异（p < 0.001）。PLE组的值[中位数10.3（10-27）]显著低于FRE组[中位数33（10-68），p < 0.001]和MrMRE组[中位数37（10-61），p < 0.001]。类似地，IRE组的犬（中位数20（10-43））与FRE和MrMRE相比显示出更低的浓度（两者p = 0.006）。FRE和MrMRE之间，或IRE和PLE之间未发现显著差异。

将CE犬的血清25(OH)D浓度与先前研究中40只健康犬的对照组进行比较。从该分析中，31%的FRE和19%的MrMRE犬的25(OH)D浓度超过了健康对照。然而，健康组、FRE组和MrMRE组之间未观察到统计学上的显著差异。相比之下，没有IRE或PLE犬的值超过既定的参考范围（13-45 ng/mL）。组间总血清钙水平存在显著差异（p < 0.001）。与25(OH)D数据一致，PLE组犬的总钙水平[中位数10（6.1-10.8）mg/dL]低于FRE组[中位数10.7（10-11.6）mg/dL，p = 0.001]和MrMRE组[中位数10.9（10.2-12.3）mg/dL，p < 0.0001]。与MrMRE组相比，IRE组的犬同样被发现钙浓度较低[中位数10.5（9.80-11.7）mg/dL，p = 0.022]。只有三只犬的血清总钙水平低于或等于参考范围下限。所有这些犬都属于PLE组。

对75只犬进行了向后多元线性回归，以确定与血清25(OH)D浓度相关的因素。实际上，研究中包含的91只犬中，有75只拥有完整的数据集，包含分析所需的所有变量。以下参数最初被纳入，但在向后消除过程中因p值 > 0.20而被排除：FS、BCS、血液学参数、ALT、AST、白蛋白、总蛋白、钠、胆固醇、肌酐、尿素和总钙。CRP、磷和果糖胺被确定为25(OH)D浓度的独立预测因子，而氯化物、甘油三酯、总胆红素和钾作为协变量保留在最终模型中，但没有显示出统计学上显著的独立效应（R² = 0.418；调整后R² = 0.357；p < 0.0001）。较低的血清果糖胺（β = 0.435，CI：0.219至0.650，p < 0.001）和磷（β = 0.204，CI：0.033至0.376，p < 0.020）与较低的25(OH)D相关，而较高的CRP（β = -0.231，CI：-0.440至-0.023，p < 0.030）与较低的25(OH)D相关。14%的犬发现血清果糖胺浓度异常。其中，12/91的犬果糖胺浓度低于参考范围。12只果糖胺浓度低的犬中有11只属于PLE组，一只属于IRE组（伴有低白蛋白和正常总蛋白）。

讨论

维生素D缺乏症在CE犬中常见。在本研究中，血清25(OH)D与基于临床状况和治疗反应的CE犬分类相对应，在表现出更严重CE表型的犬中观察到较低的浓度。在PLE犬中，低血清25(OH)D浓度已被确定为负面预后因素，死亡或被安乐死的犬与存活的犬相比维生素D浓度更低。我们的研究不能被视为一项预后调查，因为医疗记录的评估并非旨在评估与死亡率的潜在关联。然而，IRE和PLE组的犬（通常与更严重的临床评分和普遍较差的预后相关）显示出最低的维生素D浓度，而与具有更好临床评分的FRE和MrMRE组的犬形成对比。尽管犬中维生素D缺乏症与CE之间的关联已得到充分认识，但目前缺乏证据支持在确诊缺乏症的病例中补充维生素D能带来临床改善。有趣的是，在未接受胆钙化醇补充治疗而是接受其基础疾病标准治疗的PLE犬中，观察到25(OH)D水平的快速升高。这表明临床改善本身可能在提高25(OH)D水平方面起作用。此外，确定补充方案的一个主要困难是，尚未为犬确定一个确切的缺乏症临界值。而在人类中，越来越多的证据表明最佳阈值在30至40 ng/ml之间，较低水平与心血管、免疫、代谢和肿瘤疾病风险增加以及全因死亡率较高相关。尽管目前没有证据表明补充维生素D能改善CE和PLE犬的临床状况，但已证明在饲喂维生素D3强化饮食的第一个月内，能有效提高缺乏症犬的血清25(OH)D浓度。在我们的研究中，血清25(OH)D浓度在CE组内和健康犬之间都表现出较大的变异性，相对较高比例的FRE和MrMRE犬的值超过了健康犬，尽管这种差异不显著。尽管我们的研究人群可能不能完全代表更广泛的CE人群，但它涵盖了各种犬种，体型从非常小到大型不等，与先前的研究类似。然而，大多数健康犬群由中型到大型犬种组成，这可能会限制结果的普适性。与先前评估健康犬以及患病犬维生素D状态的研究一致，年龄在我们的研究中并非血清25(OH)D浓度的预测因子。在犬中，血清维生素D浓度在很大程度上取决于饮食摄入，现有数据表明犬血清25(OH)D浓度根据所使用的日粮品牌和补充剂而有显著差异。虽然排除了接受含维生素D补充剂的犬，但并非所有犬在血清采样时饲喂的特定日粮都有完整记录。虽然目前缺乏胃肠道治疗日粮与标准维持日粮之间维生素D含量的直接比较，但前者可能比标准维持日粮含有更高的维生素D浓度，因为兽医胃肠道日粮的配方旨在解决吸收不良问题并支持粘膜恢复。

维生素D在矿物质稳态中起关键作用，主要是通过增强肠道对钙和磷的吸收。较高的血清25(OH)D浓度通常与活性维生素D形式（1,25(OH)₂D）的更大可用性相关，后者促进肠道对这两种矿物质的吸收增加。这种生理机制可以解释我们研究中观察到的血清25(OH)D与磷浓度之间的正相关。尽管钙在维生素D代谢中处于核心地位，但血清总钙被排除在最终回归模型之外。因此，总钙与维生素D状态之间缺乏关联可能是由于在本研究中仅使用总钙作为钙血症标志物的局限性。这是因为总钙不能准确代表钙的生物活性部分，并且受血清白蛋白和其他蛋白结合组分的影响。CE犬的总血清钙常常降低，但它并非诊断或预后的特异性或独立标志物。然而，在本研究人群中，总钙水平反映了CE犬的临床特征，在患有IRE和PLE的犬中观察到较低的水平。话虽如此，离子钙（iCa）能更可靠地反映生理活性形式，本是评估此背景下钙状态的更合适参数。

甲状旁腺激素（PTH）测量在评估维生素D状态中起关键作用，因为即使血清维生素D浓度处于临界或低正常范围，PTH浓度升高也可能表明活性维生素D形式缺乏。由于本研究的犬无法获得iCa和PTH测量值，我们无法全面评估其维生素D和钙状态。

总的来说，尚不清楚低维生素D是导致慢性炎症性肠病发展的原因，还是仅仅是其后果。新兴证据表明，维生素D缺乏症可能在CE的多因素病因中涉及的因素（如肠道炎症和免疫系统失调）的发生中起因果作用。低维生素D状态与CE犬的全身性和胃肠道炎症呈负相关。升高的炎症标志物，包括中性粒细胞和单核细胞计数，以及促炎细胞因子，如IL-2和IL-8，与低血清25(OH)D浓度相关，加强了炎症与维生素D缺乏之间的联系。

CRP是一种急性期蛋白，在全身性炎症反应中升高，可以作为CE犬诊断检查的一部分进行测量。当在PLE犬入院后1-3天内测量时，CRP被确定为负面预后因素，在死亡率较高的犬中观察到较高的浓度。在我们的研究中，低维生素D浓度与较高的CRP值相关，类似的维生素D状态与CRP之间的反向关系在出现血腹的犬中也有观察到。

白蛋白是一种负急性期蛋白，也是CE犬的负面预后因素。低白蛋白浓度与维生素D缺乏直接相关，患有低白蛋白血症的犬，如PLE犬，根据其病情的严重程度，可能面临维生素D缺乏的风险增加。肠道吸收不良或维生素D结合蛋白丢失已被提出作为患有炎症性肠病和低白蛋白血症的犬发生维生素D缺乏症的可能原因。与最近一项关于PLE犬的研究发现相反，在本研究中，白蛋白浓度与总人群中的维生素D状态无关，而维生素D浓度在PLE和IRE犬中均低于FRE和MrMRE组。与我们的发现一致，一项调查犬旋毛虫病犬维生素D缺乏症的研究报告称，所有患病犬无论白蛋白浓度如何，均出现低维生素D浓度。与健康对照组相比，仅在使用肿瘤形式并出现腹泻的犬中观察到白蛋白浓度降低。

在本研究中，血清25(OH)D与果糖胺浓度之间的正相关可能受血清蛋白状态，特别是白蛋白的影响。虽然果糖胺主要用于监测糖尿病动物的血糖，但其浓度也受蛋白浓度的影响。维生素D部分与白蛋白结合在血液中运输，而果糖胺反映血清蛋白（主要是白蛋白）的糖化程度。在蛋白浓度低的犬中，血清果糖胺往往低于正常水平，这种降低的程度可以提供一些关于蛋白缺乏持续时间的见解。在这群CE犬中，低白蛋白血症是PLE犬的一个特征，维生素D与果糖胺之间的相关性可能在很大程度上反映了蛋白质可用性的变化和较差的蛋白质状态，而不是血糖控制本身。

尽管果糖胺和CRP是最显著的预测因子，但其他变量，如氯化物、甘油三酯、总胆红素和钾，被保留在最终回归模型中。虽然这些变量没有显示出独立的统计学显著性，但它们的纳入可能反映了潜在的生理相互作用、稳态机制或与主要预测因子的相关性。这种模式突出了25(OH)D浓度的多因素调节，并表明各种代谢和炎症因素可能共同影响维生素D状态。

本研究的回顾性设计导致了几个局限性。首先，给予犬的药物和饮食治疗缺乏标准化，医疗记录中可用的实验室参数也缺乏标准化。此外，仅纳入具有完整数据集的病例可能引入了潜在的选择偏倚，这种偏倚既来自医疗记录编译的准确性和完整性，也来自主人提供信息的精确性，这可能最终限制对普通人群的代表性。最后，缺乏iCa和PTH测量值，阻止了对研究人群中维生素D和钙状态进行更全面评估。

结论

这项回顾性研究为了解犬慢性肠病的维生素D状态提供了有价值的见解，显示了对不同治疗方案有反应的犬之间维生素D水平的差异。值得注意的是，CRP和果糖胺这些易于获取的参数，可能代表了维生素D浓度的潜在关联物，值得进一步验证。需要进一步的研究来阐明维生素D缺乏对慢性肠病犬的长期影响，并确定补充维生素D是否可能有益。