大西洋鲑头肾细胞中ISAV和IPNV感染后免疫应答的翻译后修饰（泛素化）与转录重编程的特征研究

《Frontiers in Immunology》：Characterisation of post-translational and transcriptional reprogramming of the immune response to ISAV and IPNV infections in salmon head kidney cells

本文综述了利用泛素化富集蛋白质组学与RNA测序技术，揭示大西洋鲑头肾细胞在感染传染性鲑鱼贫血病毒和传染性胰腺坏死病毒后，宿主蛋白泛素化状态发生的显著变化及其对先天免疫应答的调控作用。研究明确了病毒特异性翻译后重编程模式，并首次将TRIM家族E3泛素连接酶等关键靶点与RIG样受体通路激活相关联，为鱼类抗病毒免疫机制及疫苗研发提供了新见解。

　　

引言：水产养殖与病毒性疾病挑战

水产养殖是满足全球日益增长的健康蛋白质需求的关键工具。然而，传染性疾病是制约鱼类养殖可持续发展的主要障碍，其中病毒性疾病由于缺乏有效的预防和治疗方案而尤为突出。传染性鲑鱼贫血病毒和传染性胰腺坏死病毒是对鲑鱼养殖业具有灾难性影响的两种重要病毒。理解宿主-病原体相互作用对于指导疫苗、抗病毒疗法或基因编辑策略的开发至关重要。

泛素化作为一种翻译后修饰，能够调节蛋白质的活化、结构和降解。虽然在模式物种中已知泛素化调节免疫功能的许多方面，但在鱼类中的研究尚不充分。本研究旨在表征泛素化在大西洋鲑应对病毒感染中的作用，特别关注宿主免疫信号通路泛素化状态的改变及其对转录组的影响。

病毒感染后的全局泛素化变化

研究采用大西洋鲑头肾细胞系，分别用ISAV和IPNV进行感染实验，并在感染后24小时和48小时这两个早期先天免疫应答时间点收集细胞裂解物。蛋白质印迹分析显示，ISAV感染导致宿主蛋白总体泛素化水平显著增加，而IPNV感染在任一时间点均未引起总体泛素化水平的显著变化。

通过泛素化富集蛋白质组学技术，研究人员对感染和对照的全细胞裂解物进行了分析。共鉴定出3224种蛋白质，经过滤后得到1418种在所有样本中均能检测到的蛋白质。主成分分析表明，样本主要按时间点分离，而非按感染类型聚类。

病毒动力学与感染指标

RNA测序数据的主成分分析显示，除了24小时的对照组和ISAV感染组聚类在一起外，其他实验组呈现明显的聚类。对病毒转录本的定量分析表明，ISAV的表达水平远高于IPNV，这与较高的感染复数一致。值得注意的是，IPNV水平在24小时至48小时间增加了约4倍，而ISAV水平保持不变。

ISAV感染诱导的转录应答滞后于翻译后应答

蛋白质印迹分析证实ISAV感染后宿主蛋白泛素化发生显著变化。蛋白质组学分析反映了这一现象，在24小时和48小时时间点，74%的差异丰度蛋白质其丰度均有所增加。质谱分析在24小时检测到17个差异泛素化蛋白质（10个增加，7个减少），在48小时也检测到17个（11个增加，6个减少），其中只有2个蛋白质在两个时间点重叠。许多是翻译后调控相关蛋白。

相比之下，ISAV感染在24小时仅引起有限的转录组应答，只有36个基因显著上调。然而，在感染后48小时观察到了重要的转录组应答，有647个基因上调（45个下调）。上调的基因包括先天干扰素抗病毒应答的经典标志物，如RSAD2、干扰素α1、RIG-I、LGP2、多种IFIT基因、IRF7和Mx2等。许多保守的TRIM基因和新型的FinTRIM及Blood Thirsty TRIM基因家族成员在感染应答中显著上调。

GO富集分析显示，ISAV感染后48小时，先天免疫病原体识别受体通路（包括RIG-I样受体信号、NOD样受体信号、Toll样受体信号和C型凝集素受体信号）被明显激活。RIG样受体通路的几乎所有组成部分均被发现上调。

IPNV感染诱导快速的转录应答但翻译后应答有限

与ISAV相反，IPNV感染在24小时和48小时均未引起宿主蛋白泛素化状态的显著变化。蛋白质组学分析进一步揭示，感染后泛素化/泛素相关蛋白的丰度普遍降低，在24小时和48小时，分别有95%和86%的显著差异丰度蛋白质其丰度减少。在极少数感染后丰度增加的蛋白质中，值得注意的是ISG-15样蛋白、多聚泛素和TRIM25样E3泛素/ISG15连接酶。

IPNV感染诱导了快速的转录组应答，在24小时有435个基因上调（仅7个下调），在48小时有2418个基因上调（463个下调）。24小时时，先天抗病毒应答的经典标志物即被上调，包括RIG样受体信号通路的多个组成部分。到48小时，更多的基因被上调，反应更为强烈。

GO富集分析表明，IPNV感染细胞的蛋白质组学数据强烈提示细胞对病毒的反应，蛋白酶体和蛋白质/氨基酸代谢是主要富集通路。转录组学数据的GO术语分析则表明，宿主对病毒的检测严重依赖于病原体相关分子模式/模式识别受体信号通路。

泛素介导的ISAV和IPNV感染转录重编程

通过加权基因共表达网络分析，研究人员将泛素化富集蛋白质组学与转录组学数据相结合，以鉴定可能受本研究鉴定的蛋白质泛素化调控的基因簇。Trim25基因（包括染色体2和染色体12上的拷贝）与一个包含其他5个TRIM样基因的簇相关。已知的病毒RNA传感器RIG-I和MDA5以及干扰素通路激活因子也与该簇相关，提示了一个潜在的激活通路机制。此外，已知在人类中与TRIM25相互作用的泛素结合酶E2N也存在于该簇中，提示了一个可能保守的E2/E3连接酶对。

多聚泛素在ISAV和IPNV感染后均呈现差异丰度。网络分析显示，泛素蛋白与许多其他翻译后调控组分相关，包括多个蛋白酶体组成部分和泛素连接酶。该网络表明，病毒感染的应答中存在翻译后修饰/泛素化机器的协调性重编程。

讨论：病毒特异性免疫调控机制的揭示

本研究通过整合泛素化富集蛋白质组学和RNA测序技术，揭示了SHK-1细胞对ISAV和IPNV感染应答的翻译后调控特征。主成分分析显示，ISAV感染初期（24小时）转录应答较弱，但泛素化修饰层面已发生剧烈变化；而IPNV感染则诱导了强烈的转录应答，同时伴随泛素化蛋白丰度的普遍降低。

对于ISAV感染，细胞反应显示出比转录应答更强的翻译后基础。感染24小时时观察到的微弱转录应答，随后在48小时出现更强的反应，这与之前研究中提出的24小时滞后期一致。泛素化可能在激活/调节宿主对感染的初始应答中发挥重要作用。ISAV感染诱导了多种蛋白生产和加工通路组分的泛素化增加，表明这些蛋白质正在发生泛素化状态的显著改变，这提示了一种由翻译后修饰控制的感染应答。

值得注意的是，ISAV感染后，多聚泛素、多聚泛素/ISG15样蛋白和TRIM25样蛋白等呈现差异丰度。TRIM25是一种RING E3连接酶，在模式物种中是先天抗病毒免疫应答的已知调节因子。本研究提供了鱼类中TRIM25样蛋白在蛋白质水平受调控的首个证据。数据表明，ssa02 ssTRIM25比ssa12 ssTRIM25在感染应答中优先被诱导，提示了某种程度的功能分化或新功能化。

许多TRIM蛋白在ISAV感染应答中显著上调，包括trim25样基因、trim16样基因、新型鱼类trim和bloodthirsty样TRIMs，证实了所有四种trim基因类型对于鱼类功能性免疫应答的重要性。

对IPNV感染的翻译后应答表征显示，宿主蛋白在感染后24小时和48小时均出现轻微的去泛素化。Nedd8通路（Neddylation）的几种蛋白质组分在感染后泛素化丰度降低，这与先前发现NEDD-8激活酶（nae1）敲除可显著降低IPNV复制的研究相呼应，突出了Neddylation在IPNV感染应答中的重要作用。

ISAV和IPNV感染均诱导了相关多聚泛素/ISG15样蛋白丰度的增加，这与相应ISG15基因的转录上调相关。ISG15已被提议通过竞争底物结合位点来负调控泛素化，这或许部分解释了为何在IPNV感染后，多聚泛素/ISG15样蛋白丰度大幅增加，而许多蛋白质的泛素化状态却降低了。

结论：泛素化在鲑鱼抗病毒免疫中的关键作用

通过泛素（以及ISG15等泛素样蛋白）对蛋白质进行翻译后修饰，在大西洋鲑应对IPNV和ISAV的早期抗病毒免疫应答的启动和调控中具有重要作用。对于ISAV感染，泛素化应答先于强烈的转录组应答。相反，对于IPNV感染，则出现强烈的转录应答，同时大多数泛素化蛋白减少。几种蛋白质的泛素化可能与RIG样受体、Toll样受体和NOD样受体信号通路的调控相关，这将翻译后修饰状态与该物种抗病毒应答的调控联系起来。

泛素组学在非哺乳动物物种中仍是一个研究不足的领域，但我们的结果强烈表明泛素和ISG15在鱼类对病毒感染的免疫应答中起着关键作用。需要进一步研究这种高度保守分子的作用，并在体内验证本文所述的观察结果，从而为鱼类免疫学提供更深入的见解。

材料与方法：实验设计与技术路线

SHK-1细胞在特定条件下培养，并用ISAV和IPNV病毒感染。感染在15°C下进行，分别在感染后24小时和48小时收集细胞。通过蛋白质印迹分析总蛋白泛素化水平。泛素化蛋白质组学分析采用HaloTag?磁性珠结合Halo-泛素素进行纯化，然后进行液相色谱-串联质谱分析。RNA测序用于分析转录组应答，使用Illumina平台进行。差异表达分析使用Deseq2进行。加权基因共表达网络分析用于整合蛋白质组学和转录组学数据，识别共表达模块。