GEODE：基于结核肉芽肿微环境优化的药物疗效预测新模型

《Frontiers in Pharmacology》：GEODE: an in silico tool that translates in vitro to in vivo predictions of tuberculosis antibiotic combination efficacy

本综述创新性地提出GEODE（Granuloma Environment Optimization of Drug Efficacy）平台，通过整合体外药效学（PD）数据、计算机模拟（GranSim）和药代动力学（PK）模型，精准预测结核病（TB）治疗方案在肉芽肿微环境中的灭菌效果。该模型首次将细菌负荷效应（inoculum effect）和休眠菌表型耐受性纳入考量，成功重现非人灵长类（NHP）和临床试验数据，为抗结核（Mtb）新药方案优化提供了强有力的计算生物学工具。

　　

捕捉细菌负荷在GranSim中的效应

细菌对抗生素的敏感性随细菌负荷变化，较高负荷可能降低药物效力（即体外研究中的“接种效应”），这种现象在结核分枝杆菌（Mtb）中亦有观察。为量化并映射Mtb负荷的影响，研究团队进行了体外实验，评估了在不同起始Mtb密度下抗生素的杀菌活性。通过这些实验，他们生成了药效学（PD）数据，以Hill曲线形式建模，描述了药物诱导的细菌杀灭（在GranSim框架中测量为杀灭比率）作为抗生素浓度的函数，针对每个细菌负荷和测试药物。

研究团队随后将这些信息转化为药代动力学相关的药物效应指标（E_PK），该指标被拟合为指数衰减曲线，捕捉了E_PK随细菌负荷增加而下降的趋势。正如预期，将不同水平细菌负荷的影响纳入模型后，预测的细菌灭菌速率变慢。

为验证捕捉细菌负荷效应的模型，他们将模拟的灭菌曲线与来自狨猴和猕猴的肉芽肿尺度数据进行了比较。他们计算了灭菌肉芽肿比率，即一组肉芽肿中灭菌的部分，针对狨猴和猕猴数据集，汇集了来自不同动物的肉芽肿，并假设检测限为每肉芽肿5个菌落形成单位（CFU），且对于某些分析，根据治疗前CFU负荷对肉芽肿进行分组。

由于狨猴往往患有进行性结核病，且许多肉芽肿具有不受控制的CFU生长，因此狨猴灭菌肉芽肿比率与仅高CFU虚拟肉芽肿的比率最匹配。他们提供的证据表明，当包含细菌负荷效应的表征时，狨猴的灭菌肉芽肿比率与GranSim非常吻合。此外，猕猴的灭菌肉芽肿比率与低CFU虚拟肉芽肿最匹配，因为大多数食蟹猕猴肉芽肿往往具有受控的CFU生长。他们在此表明，当在模型中表示细菌负荷效应时，猕猴的灭菌肉芽肿比率与低CFU肉芽肿的灭菌曲线一致。

从DiaMOND数据生成完整的棋盘格

研究团队开发了一种方法，利用通过DiaMOND测量的体外数据重建完整的棋盘格，从而能够估计所有药物浓度组合的杀菌效果。该过程包括三个主要步骤：(1) 将基于生长抑制的Hill参数转换为杀菌参数；(2) 使用单药反应、等效组合数据和药物相互作用评分推导每种药物组合的新Hill方程参数；(3) 基于这些推导的参数计算每种组合的杀灭速率。该方法提供了比标准部分棋盘格方法更全面和可扩展的药物相互作用预测。

通过模拟临床相关方案将生长条件映射到具有药物相互作用的GranSim中的PD

由于本研究的目标是通过结合不同的药物方案筛选方法来提高预测临床试验成功方案的能力，因此他们将不同细菌生长条件下的体外组合反应数据整合到GranSim中，用于不同的药物方案。在GranSim中，他们假设Mtb可以根据其不同位置呈现三种不同的表型：巨噬细胞内的细胞内Mtb、肉芽肿组织中的细胞外复制Mtb以及肉芽肿干酪坏死核心内 trapped 的非复制Mtb。使用先前发布的体外数据，他们选择了三种体外模型，这些模型共同预测了BALB/c复发小鼠模型中的治疗结果：这些模型包括具有不同唯一碳源（丁酸盐或0.2 mM胆固醇）的培养基和标准生长培养基中的酸性条件。

为捕捉与特定Mtb亚群相关的药物药效学（PD），他们使用酸性和丁酸盐条件下的平均杀灭速率来代表细胞内Mtb，并使用丁酸盐和高胆固醇条件下的平均速率来代表细胞外复制Mtb。为模拟存在于干酪组织中的非复制Mtb的PD，他们开发了一系列不同pH和氧水平的体外休眠条件：酸性常氧（AN）、中性低氧（NH）和中性常氧（NN）。使用DiaMOND方法在这些休眠条件下评估药物组合。他们在这些休眠条件下评估了五种临床相关组合（HRZE、HRZM、RMZE、BPaL和BPaMZ），以评估其预测临床结果的能力。

先前的研究发现，在不同生长应激条件下测量的体外数据比单一应激条件下的体外数据能更好地预测体内结果。基于此先前工作，他们寻求生成复合应激条件配置文件以参数化GranSim。为此，他们首先计算了组成组合的各个应激条件下每种药物方案的杀灭速率。然后，根据为模拟组合效应所选择的策略，使用平均、最大或最小杀灭速率聚合这些值，这导致以下组合条件：AN_NH-min、AN_NH-max、AN_NH-mean、AN_NN-min、AN_NN-max、AN_NN-mean、NN_NH-min、NN_NH-max、NN_NH-mean、AN_NN-min、AN_NN-max、AN_NN_mean、AN_NN_NH-min、AN_NN_NH-max、AN_NN_NH-mean。

他们首先在GranSim中模拟了临床相关方案（HRZE、RMZE、HRZM、BPaL和BPaMZ），考虑了所有个体条件和所有可能的聚合条件，以确定最能代表临床或体内结果的条件。由于 trapped 在干酪中的非复制细菌水平很可能是最难用药物清除的群体， due to 药物耐受和渗透问题，因此作用于该群体的药物的PD显著影响灭菌动力学也就不足为奇了。

虽然一些方案的灭菌动力学显著依赖于所选条件，但灭菌曲线的一些特征在大多数条件下是共同的。例如，在几乎所有测试的休眠模型中，RMZE表现最差，除非BPaMZ具有最低效力。此外，BPaL通常是表现最好的，除非使用AN_NN-max代表非复制Mtb的PD，此时BPaMZ最快地灭菌肉芽肿。

为系统地确定反映临床和动物研究的生长条件，他们使用方程24对所有模拟的单体和复合休眠条件下的相同五种方案进行了排名。为选择代表体内条件的单一体或复合休眠条件，他们的主要标准是含BDQ和PTM的方案应优于HRZE，因为先前已显示包含BDQ和PTM可提高方案相对于HRZE的效力。只有AN_NH-max、NN_NH-max、AN_NN-max和AN_NN_NH-max满足这些标准，其中BPaL和BPaMZ是表现最好的方案。接下来，他们预期HRZE不应优于HRZM。HRZE和HRZM的相对表现存在争议，因为一些研究声称HRZM比HRZE更有效，而临床结果提供的证据表明HRZM并不非劣于HRZE。尽管如此，据他们所知，没有研究表明HRZE可能优于HRZM。这两个标准给他们留下了三个条件：AN_NH-max、NN_NH-max和AN_NN_NH-max。由于这些条件中的每一个都具有相似的灭菌动力学，他们通过选择一个并将AN_NH-max映射到非复制Mtb的PD来继续分析。

使用NHP和临床研究验证GEODE

在上述部分中，他们分离出两个对准确抗生素模拟至关重要的新组件——细菌水平的影响和GranSim中休眠的现实表征。现在他们加入了第三个特征：药物相互作用的体外测量，以完成他们扩展的药物模拟平台：GEODE（肉芽肿环境药物疗效优化）。GEODE是他们新颖的药物方案疗效预测模型，将药物相互作用PD与他们在肉芽肿内模拟PK/PD动力学的GranSim计算模型相结合。

为验证GEODE，他们将治疗模拟与NHP和临床研究进行了比较。他们使用了来自两种不同类型NHP的数据集：猕猴和狨猴。食蟹猕猴是人类Mtb感染的准确模型，而普通狨猴几乎 exclusively 发生进行性疾病。他们分析了模拟的三个特征：(a) 治疗响应中所有肉芽肿的时间CFU轨迹，(b) 基于肉芽肿灭菌时间的方案排名，以及(c) 治疗后整体肉芽肿代谢活性的变化，这可以模拟并通过PET/CT扫描的FDG亲合力进行实验量化。

对于狨猴方案，他们观察到实验和模拟排名之间存在良好的相关性。具体而言，低CFU肉芽肿的模拟排名与基于纤维化狨猴肉芽肿的排名密切相关，后者往往具有更受控制的CFU生长，相关性为ρ = 0.68。高CFU肉芽肿排名与坏死狨猴肉芽肿排名的相关性较低，为ρ = 0.52。类似地，与狨猴方案一样，当与临床排名中使用的相同方案进行比较时，低CFU肉芽肿的相关性更好。然而，临床方案的总体相关性低于狨猴方案。总体而言，他们观察到对于大多数高CFU肉芽肿，含BDQ和PTM的方案在模拟中是最佳的。

为评估三种独特抗生素方案的药物疗效，他们还测量了治疗过程中肺肉芽肿的代谢活性。在NHP研究中，肉芽肿在动物体内随时间跟踪，并测量大小和FDG亲合力。在模拟中，他们也以SUVR的形式捕获此测量值。他们比较了GEODE模拟和NHP研究之间的这两个分数。NHP肉芽肿中SUVR的倍数变化表明，大多数治疗倾向于降低肉芽肿内的代谢活性，因为大多数治疗的SUVR变化模拟平均值是负的（除了RMZE治疗8周后的SUVR变化平均值）。然而，也存在治疗后代谢活性增加的NHP和虚拟肉芽肿。他们观察到，响应8周HRZE治疗的SUVR倍数变化显著小于RMZE，意味着HRZE比RMZE在猕猴肉芽肿中更多地降低了代谢活性。类似地，在治疗结束时，用RMZE治疗的狨猴往往比用HRZE和BPaL治疗的狨猴具有更严重的病理学。用BPaL在肉芽肿尺度上治疗狨猴在所有三种方案中产生最改善的PET/CT病理学。

所有模拟肉芽肿中使用方程22,23计算的FDG亲合力倍数变化（log₂转换）显示与NHP数据集相似的结果：用这些方案治疗在所有情况下都降低了代谢活性，如负FDG亲合力倍数变化值所示。此外，RMZE治疗在所有三种治疗中导致最高的FDG亲合力变化，表明代谢活性的降低在响应RMZE治疗时是最低的。BPaL治疗显示代谢活性的最大降低。然而，在FDG亲合力方面，计算机模拟和体内趋势之间存在一些差异。例如，虽然体内8周HRZE治疗后的倍数变化低于4周后观察到的变化，但在计算机模拟中这些组之间没有显著差异。这可能源于代谢活性动力学的差异；模拟显示FDG亲合力呈指数下降，与体内观察到的趋势形成对比。最后，低CFU与高CFU肉芽肿之间FDG亲合力的变化表明，方案之间FDG亲合力的差异主要源于在高CFU肉芽肿中观察到的代谢差异，并且这些差异在高CFU肉芽肿中更为明显。

讨论

通过更好的工具在临床试验前预测疗效，将促进结核病治疗的改进。目前有一系列工具用于此目的，但没有一个能跨平台整合，从细菌动力学到宿主尺度动力学。这项工作的一个关键目标是将来自体外和体内研究的数据集整合到我们的计算模型GranSim中，该模型模拟肉芽肿形成和功能以及多种抗生素方案的PK/PD动力学。

在这项研究中，他们开发了一个新的计算平台GEODE，它将肉芽肿治疗的计算机模型与在不同体外条件下生长的Mtb的体外PD和PD药物相互作用测量相结合。该模型已使用来自结核病NHP模型的数据集进行了校准，这些数据集已经整理了20年。这种新颖的方法不同于他们先前在肉芽肿尺度上计算机模拟结核病治疗的研究，在那里他们使用了杀菌（标准培养基和干酪模拟测定）和巨噬细胞测定来模拟药物PD，并使用来自INDIGO的预测FIC值来捕捉药物相互作用。GEODE通过几种方式捕捉了更细微的结核病动力学描述。首先，体外应激条件模拟了各种体内肉芽肿微环境，因此他们新的PD数据集比标准化测定的数据集更相关。此外，他们在各种应激条件下测量了药物相互作用，而先前他们使用了基于机器学习的药物相互作用预测来自INDIGO研究。最后，GEODE中代表的所有药物的PD测量都是使用相同的实验平台生成的，使其比异源校准更一致。

他们的GEODE管道涉及一个详细的方法来计算所有药物组合的PD（即使用对角线、x轴和y轴的整个棋盘格），使用最小信息。据他们所知，这是第一个使用最小信息计算详细药物相互作用预测的方法。因此，这种方法可以最小化PD和药物相互作用测量所需的资源，不仅适用于结核病方案，也适用于其他需要棋盘格测定来评估组合方案相互作用的疾病治疗，如癌症和HIV。他们计算的一个有趣结果是棋盘格的轮廓可能具有复杂和不规则的形状。这是由于将两个不同的FIC值（FIC50和FIC90）纳入他们的计算中，这些值并不总是平行的。这意味着轮廓可以在棋盘格的不同部分凹入（如协同药物组合）或凸出（如拮抗药物组合）。

所有应激条件组合的一个有趣结果，包括他们选择用于代表GranSim中非复制Mtb PD的那个（AN_NH-max），是方案RMZE是临床相关方案中表现最差者之一——甚至比标准方案HRZE更差。RMZE的效力存在争议，因为一些研究声称RMZE优于HRZE，而一些显示RMZE对HRZE的非劣效性。然而，来自狨猴和猕猴研究的PET/CT数据表明，用RMZE治疗的NHP肉芽肿显示代谢变化量最少。这与他们模拟肉芽肿的FDG亲合力变化一致，其中响应RMZE治疗的FDG亲合力水平下降在与HRZE和BPaL比较时是最低的。还值得注意的是，FDG亲合力是方案性能的一个不太精确的指标，因为方案之间的差异并不总是显著的（例如，图9B中的BPaL和HRZE）。灭菌时间提供了更清晰的治疗疗效衡量标准，因为它直接反映了细菌的存在或 absence。相比之下，FDG亲合力反映了代谢活性，即使在缺乏活菌的情况下也可能保持升高。

为进一步验证他们的PD模型，他们模拟了三种药物方案，以与狨猴研究和临床试验进行比较。他们的低CFU虚拟肉芽肿与实验和临床研究最相关。方案排名表明，用于生成PD数据的应激条件模拟了低CFU、较少干酪的肉芽肿微环境。此外，他们观察到模拟的方案排名与狨猴方案排名的一致性高于已发布的临床排名。这可能是由于几个原因。首先，临床排名发生在整个宿主尺度，不同于他们的肉芽肿尺度模拟。临床排名将包括其他肺外因素，如淋巴结感染和疾病复发或宿主具有多个肺肉芽肿的影响。接下来，来自临床研究的方案仅是这五种药物HRZEM的组合，只有剂量和给药频率不同。他们汇集了几种不同的方案以匹配他们的HRZE排名。因此，反映模拟和临床研究之间的这些细微差异可能更困难，导致弱相关的排名。然而，来自狨猴研究的方案具有更广泛的PKPD特征，具有固定剂量和频率，使得区分排名更容易。模拟和NHP数据之间的高相关性表明，他们成功地捕捉了所有方案在临床每日给药条件下的PKPD动力学。

虽然相关系数对评估模型有信息量，但它们不能捕捉预测中的系统偏差。他们相关性图的线性拟合表明，他们的模型略微低估了实验和临床排名。这可能 due to 缺乏宿主尺度动力学，如淋巴结或多个肺肉芽肿。为进一步改进他们的临床预测，当前的工作重点是通过使用他们开发的全宿主尺度模型来适应这种方法，即HostSim，其中包括淋巴结和多个肺肉芽肿的动力学。他们用这个模型测试虚拟队列中的药物方案。通过这种方法，他们旨在做出更具临床相关性的预测。

他们在相关性图中为临床和狨猴分析观察到一些异常值。狨猴和GranSim之间的显著差异是PTM的排名，其在GranSim中表现明显更好。这可能 due to 狨猴更快地发展出更进行性的疾病，具有更多干酪肉芽肿，阻止PTM的有效渗透，显著影响其效力。在GranSim和临床排名之间的相关性图中，仅含INH或RIF的方案在GranSim中往往比临床试验表现更好。RIF能很好地渗透到肉芽肿中，因此在其肉芽肿尺度模型中表现更好。然而，在临床中，他们需要使用其他药物组合方案，如EMB和PZA，以防止耐药性，这目前尚未在这些模拟中捕捉到。

细菌水平的影响是一种现象，其中由于存在更多微生物（体外研究中的接种效应），药物效力降低。这种现象先前已在几种细菌物种中观察到，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和Mtb。先前已开发了一个数学模型来使用ODE表征细菌负荷的影响，其中药物的有效浓度随细菌种群增加而减少。在这里，他们通过基于肉芽肿中细菌数量修改药物杀灭速率，将细菌负荷的影响类似地纳入GEODE。他们使用体外数据对此进行校准，这些数据显示当对不同细菌负荷的细菌平板施用不同抗生素时的PD。正如预期，他们观察到由于细菌水平的影响，肉芽肿灭菌速率显著降低，与体内测量一致。他们注意到，来自猕猴的灭菌肉芽肿比率与包括细菌负荷动力学的模拟低CFU肉芽肿的灭菌肉芽肿比率相当。相比之下，当包括细菌负荷效应时，狨猴的灭菌肉芽肿比率与模拟高CFU肉芽肿的比率相当。

这随之而来，因为大多数猕猴肉芽肿具有受控的CFU生长，如他们的模拟低CFU肉芽肿，而狨猴肉芽肿往往具有高的、不受控制的CFU生长，如他们的模拟高CFU肉芽肿。然而，他们对治疗响应中肉芽肿代谢活性的分析表明，在猕猴、狨猴和模拟高CFU肉芽肿中分别观察到RMZE的高代谢活性。这是违反直觉的；然而，几项研究表明FDG亲合力与CFU水平不相关。另一个违反直觉的结果是，纤维化狨猴排名与低CFU肉芽肿更好地相关，如较高的相关系数ρ所证明。这可能是 due to 他们的肉芽肿应激条件代表细胞肉芽肿内的微环境，这些肉芽肿倾向于控制CFU生长，类似于他们的模拟低CFU肉芽肿集。

GEODE是一个新颖而强大的工具，用于评估结核病方案疗效和计算更高阶组合（具有三种或更多药物的组合）的PD和药物相互作用，这需要来自等效组合的数据。这意味着他们需要为所有感兴趣的组合生成等效数据。然而，可以改进该方法，以便可以从所有双向组合预测高阶组合的PD。例如，这可以通过将剂量反应模型整合到他们的方法中来完成。这是一个数学模型，使用底层药物对预测高阶组合的效力。这将显著减少GEODE管道所需的实验数量，并允许他们测试所有可能的高阶组合而无需额外实验。

可以改进的另一个领域是当前版本的GEODE主要预测具有受控CFU负荷的肉芽肿的结果，即低CFU肉芽肿。然而，具有不受控制CFU生长的高CFU肉芽肿是更难治疗的肉芽肿，导致治疗失败。优化高CFU肉芽肿的治疗将使GEODE成为改进结核病治疗的更强大工具。为此，可以设计模拟干酪、高CFU肉芽肿微环境的新应激条件，以为GranSim生成PD数据。这个版本的GEODE将潜在地预测高CFU肉芽肿中的治疗结果，因为干酪肉芽肿的CFU趋势往往不受控制地增加。他们旨在在未来的工作中解决这些问题以改进GEODE。