芹菜素通过调节β3-AR和TLR4通路重塑外周与骨骼脂肪细胞促进适应性产热

《Frontiers in Endocrinology》：Apigenin promotes remodeling of peripheral and skeletal adipocytes in response to β3-AR and TLR4 activation

本综述系统阐述了天然黄酮类化合物芹菜素（Apigenin）在炎症条件下通过抑制TLR4通路、减轻脂肪组织炎症，特异性促进腹股沟白色脂肪组织（iWAT）褐变（browning），恢复β3-AR激动剂CL316,243诱导的适应性产热。研究揭示了Apigenin对脂质代谢（脂肪酸氧化与de novo脂生成）的双向调节作用，并首次发现其可诱导骨髓脂肪组织（BMAT）积累而不影响骨微结构，为代谢性疾病及骨骼健康的协同干预提供了新靶点。

　　

芹菜素促进外周和骨骼脂肪细胞响应β3-AR和TLR4激活的重塑

1 引言

炎症通过多种机制损害脂肪细胞褐变，削弱适应性产热对肥胖和代谢紊乱的保护作用。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在培养的棕色脂肪细胞中导致β3-肾上腺素能受体（β3-AR）缺陷，而TNF受体缺失可减少棕色脂肪细胞凋亡并增强肥胖小鼠的β3-AR和UCP-1表达。Toll样受体4（TLR4）被高脂饮食（HFD）或脂多糖（LPS）激活后会损害小鼠的适应性产热，而TLR4敲除则在炎症存在下保护脂肪组织褐变。巨噬细胞通过直接粘附相互作用（如α4整合素-VCAM-1）或分泌促炎细胞因子（如IL-1β）抑制米色脂肪生成和UCP1诱导。然而，肥胖中升高的其他细胞因子如IL-18和IL-10在棕色脂肪组织（BAT）产热中扮演不同角色，表明炎症与适应性产热间的联系复杂且分子基础尚未明确。

芹菜素（Api；4’,5,7-三羟基黄酮）是广泛存在于水果和叶菜中的黄酮类化合物，具有抗肥胖和改善代谢紊乱的潜力。先前研究表明，Api通过激活Nrf2通路调节脂质代谢和氧化应激，预防HFD喂养小鼠的非酒精性脂肪肝病（NAFLD）进展，并改善血脂异常、肝脏脂肪变性和胰岛素抵抗。Api还能降低肥胖小鼠肝脏和脂肪组织中的炎症标志物和免疫细胞浸润，通过调节PPARγ减少NF-κB激活并促进M2巨噬细胞极化。此外，Api在原发性人类脂肪细胞培养中通过PGE2-EP4信号通路减轻IL-1β诱导的炎症并促进米色脂肪细胞发育。本研究旨在评估Api在体内炎症条件下激活适应性产热的效果，重点关注外周脂肪细胞褐变、脂质动态变化以及骨骼脂肪细胞和骨参数的潜在改变。

2 材料与方法

2.1 试剂与化学品

β3-AR激动剂CL316,243、二甲基亚砜（DMSO）和大肠杆菌O111:B4来源的LPS购自Sigma-Aldrich。Api购自Selleck Chemicals并溶解于DMSO。TRIzol试剂和DNase处理试剂盒购自Invitrogen。Fast SYBR green Master Mix和cDNA合成试剂盒购自Applied Biosystems。

2.2 动物实验

所有实验方案经沙特阿拉伯国王大学机构研究伦理委员会批准（批准号KSU-SE-18-39）。C57BL/6雄性小鼠饲养于22-24°C、45%湿度、12小时光暗循环环境中。6-8周龄小鼠（每组8-11只）隔天腹腔注射100 μl vehicle（0.9% NaCl + DMSO）、低剂量LPS（8 μg/只，相当于24,000 EU）或LPS + Api（30 mg/kg体重），持续2周。LPS剂量和持续时间基于先前发表的研究选择。Api处理剂量和持续时间根据先前显示显著抗炎作用的研究确定。为刺激产热，在最后5天腹腔注射CL316,243（1 mg/kg体重）。麻醉通过吸入30% v/v异氟烷溶液诱导，动物通过颈椎脱位处死。处死时收集脂肪组织，液氮速冻并保存于-80°C直至分析。

2.3 体温测量

核心体温通过直肠探头插入成年小鼠肛腔测量，并用数字监测器记录。表面体温使用数字红外温度计测量。每只小鼠计算三次读数的平均值。

2.4 血液样本分析

非空腹血浆甘油三酯（TG）和游离脂肪酸（FFA）水平使用酶比色法试剂盒测量。葡萄糖水平使用商业ELISA试剂盒测量。

2.5 定量实时聚合酶链反应

总RNA使用TRIzol试剂提取，并通过氯仿-异丙醇法分离。为去除基因组DNA污染，RNA用DNase处理纯化。使用2 μg RNA进行逆转录。基因表达通过实时qPCR评估。数据归一化至36B4或Gapdh，计算相对基因表达水平。基因特异性引物序列列于补充表S1。

2.6 苏木精-伊红染色

脂肪组织样本立即固定于10%缓冲福尔马林。石蜡包埋脂肪组织切片为10 μm厚进行H&E染色。胫骨清理后固定于10%缓冲福尔马林48-72小时，然后在石蜡包埋和H&E染色前用14% EDTA脱钙。

2.7 线粒体DNA定量通过qPCR

从小鼠皮下脂肪组织使用DNAzol提取基因组DNA。使用线粒体DNA（mtDNA）特异性引物（16S rRNA）和核DNA特异性引物（己糖激酶2）进行重复定量PCR。结果基于mtDNA和核DNA扩增的阈值周期值差异计算。

2.8 蛋白质印迹分析

脂肪组织总蛋白裂解物使用冰冷冷RIPA裂解缓冲液 supplemented with protease and phosphatase inhibitors获得。蛋白质通过10% SDS-PAGE凝胶分离，转移至PVDF膜，并与适当一抗孵育。针对p-HSL（Ser660）和UCP1的抗体购自Thermo Fisher Scientific，GAPDH抗体购自Cell Signaling Technology。印迹使用ChemiDoc MP成像系统可视化。

2.9 微型计算机断层扫描

胫骨收集并去除所有软组织。骨骼固定于10%缓冲福尔马林3天，并使用X射线微CT系统扫描。

2.10 统计分析

两组比较使用Student’s t检验。多组比较使用单因素ANOVA followed by Tukey’s多重比较检验。所有数据表示为平均值±SEM。P<0.05, P<0.01, P<0.001, P<0.0001被认为具有统计学显著性。

3 结果

3.1 芹菜素恢复LPS注射小鼠中CL诱导的适应性产热

为研究Api在炎症条件下对适应性产热的保护作用，C57BL/6小鼠在2周内注射vehicle、LPS或LPS + Api。在最后5天，除对照组外所有小鼠用CL处理以激活适应性产热。CL处理在所有处理组中引起适度的体重减轻，但CL处理组间无显著差异。Api给药在LPS+CL存在下未显著影响脂肪组织重量，但恢复了CL诱导的食物摄入增加（在LPS组中被抑制）。尽管食物摄入增加，Api补充小鼠体重和脂肪组织重量无变化，表明适应性产热激活。对此，我们测量核心和表面体温，发现Api补充在LPS+CL处理小鼠中显著增加两者温度。虽然CL处理导致所有CL处理组血浆TG和FFA水平显著降低，以及葡萄糖水平适度降低，但Api补充与LPS+CL组相比未显著影响这些参数。这些数据表明Api补充在LPS存在下恢复CL诱导的适应性产热。

3.2 芹菜素减轻炎症并增强LPS注射小鼠中CL诱导的iWAT褐变和脂质代谢

我们检查iWAT以确定Api补充是否通过抑制炎症和促进iWAT褐变恢复LPS注射小鼠中CL诱导的适应性产热。iWAT中炎症标志物Mcp-1、Il-1β和Tnf-α的基因表达在Api给药后显著降低。Api处理还与棕色样形态增加相关。此外，与LPS+CL组相比，接受Api+LPS+CL的小鼠显示Ucp1基因表达以及其他棕色脂肪特异性标志物包括Cox8b、Elovl3、Dio2、Cidea和Prdm16的显著上调。此外，CL诱导的mtDNA含量增加（被LPS抑制）被Api处理恢复。p-HSL和UCP1的蛋白水平在Api给药后也升高。而且，与LPS+CL组相比，Api+LPS+CL处理的小鼠显示与脂肪酸氧化和脂生成相关基因的更高表达。这些数据表明Api在LPS和CL处理的小鼠iWAT中减少炎症、促进iWAT褐变并增强脂质代谢。

3.3 芹菜素对产热和脂质代谢的影响在iWAT中检测到，但在iBAT或eWAT中未观察到

我们评估Api在iWAT中观察到的产热效应是否在其他脂肪库中可重现。Api给药对LPS+CL处理小鼠肩胛间棕色 adipose tissue（iBAT）中脂肪细胞形态无影响。此外，Api不影响iBAT中Ucp1或其他产热标志物的基因表达水平。Api处理也未增加iBAT中p-HSL和UCP1的蛋白表达水平。而且，Api补充后未观察到与脂肪酸氧化或de novo脂质合成相关基因表达的变化。在附睾 white adipose tissue（eWAT）中，Api与LPS给药在CL注射小鼠中未诱导棕色样形态。实际上，Api负调控LPS+CL处理小鼠中UCP1和其他产热标志物的基因表达水平。与LPS组相比，Api+LPS处理后eWAT中p-HSL或UCP1的蛋白水平无变化。此外，Api负调控LPS + CL注射小鼠eWAT中与脂肪酸氧化和de novo脂质合成关键酶的基因表达；然而，这些减少并非对所有测试基因均具有统计学显著性。这些数据表明Api在CL刺激期间的褐变效应在LPS注射小鼠中特异性针对iWAT。因此，在CL刺激小鼠中Api + LPS组观察到的增强适应性产热主要由iWAT褐变介导。

3.4 芹菜素单独在无LPS和CL刺激时不诱导产热

虽然Api能够逆转LPS对CL注射小鼠iWAT褐变的负面影响，但尚不清楚Api单独在无任何产热刺激下是否能诱导iWAT褐变。为解决此问题，C57BL/6小鼠注射DMSO或Api持续2周。两组间体重或脂肪组织重量无差异。此外，Api处理未增加表面或核心体温。组织学分析显示Api处理小鼠iWAT中无棕色样形态。而且，Api未上调iWAT中产热标志物。总体而言，由于Api单独无法刺激iWAT褐变，它可能通过干扰与抑制iWAT褐变相关的LPS相关机制改善CL诱导的iWAT褐变在LPS注射小鼠中。

3.5 芹菜素在LPS注射小鼠适应性产热期间促进BMAT积累而不影响骨参数

鉴于Api对外周脂肪组织有不同影响，我们研究它是否也影响BMAT，通过检查用LPS单独或Api + LPS处理随后CL处理的小鼠胫骨。胫骨组织学分析显示Api处理后BMAT含量显著增加。从小鼠骨髓（BM）和胫骨分离RNA。BM分析显示与LPS组相比，Api + LPS组中脂肪生成基因表达（Pparγ、Fabp4和Adipoq）显著增加。相反，胫骨中成骨标志物（Runx2、Osx和Alp）的表达在Api +LPS和LPS组间无差异。尽管这些小鼠中BMAT诱导，微CT分析表明小梁或皮质骨参数微结构无显著影响。在经历适应性产热的Api + LPS注射小鼠骨微环境中观察到的BMAT和脂肪生成标志物增加似乎独立于iWAT褐变。这得到以下事实支持：单独用Api处理的动物（未显示产热增加）也显示更高BMAT含量和BM中脂肪生成标志物显著增加与其对照相比。令人惊讶的是，Api处理单独对成骨标志物基因表达有积极影响。然而，微CT分析显示Api单独组小梁或皮质骨参数无变化。

为了更好地理解β3-AR激活和炎症对骨稳态的广泛影响，我们接下来检查这些实验条件下基因表达和骨结构的变化。我们的发现表明，小鼠中β3-AR激活抑制BM中脂肪生成标志物并适度诱导胫骨中成骨标志物，而不影响骨参数。相比之下，经历CL刺激的动物中LPS存在导致骨中脂肪生成或成骨标志物表达无变化，但导致小梁骨BV、Tb.N和BMD显著降低，而不影响皮质骨参数。总之，这些数据表明Api处理逆转CL诱导的BM中脂肪生成标志物下调并减轻LPS诱导的小梁骨参数恶化。

4 讨论

本研究阐明了Api在炎症条件下拯救小鼠适应性产热的潜力。如我们提出的模型所示，Api通过促进iWAT褐变减轻炎症并增强适应性产热。Api诱导的iWAT褐变伴随与脂肪酸氧化和de novo脂肪酸合成相关基因表达增加。有趣的是，在iBAT中未观察到产热或脂质代谢变化，而这些过程在eWAT中被抑制。因此，Api在炎症条件下恢复产热似乎主要通过其对iWAT的影响介导。此外，Api在经历适应性产热的LPS注射小鼠中促进BMAT扩张而不改变骨参数。

Api对脂肪细胞的产热效应已被我们小组和其他人报道。在先前研究中，我们证明Api处理原发性人类脂肪细胞恢复双丁酰-cAMP诱导的褐变并增强线粒体含量和功能，无论IL-1β存在与否。Api的这种褐变效应通过涉及抑制NF-κB激活以及激活COX2/PGE2轴和EP4信号的机制介导。此外，一项研究报道内皮细胞和脂肪细胞之间的串扰通过涉及VEGF刺激的机制介导Api诱导的脂肪细胞褐变。Xiong等人最近的一项研究也证明Api促进肥胖小鼠白色脂肪细胞褐变，以及3T3-L1和原发性小鼠脂肪细胞。这种脂肪细胞褐变效应归因于Api通过激活PI3K-Akt-mTOR通路对自噬的抑制效应。而且，纳米颗粒封装的Api使用最近显示在肥胖小鼠脂肪组织中诱导免疫调节并促进产热标志物表达。

在当前研究中，我们的数据证明Api在恢复LPS注射小鼠中CL诱导的适应性产热方面有效，如核心和表面体温增加所证明。而且，我们的结果揭示了棕色样形态、棕色特异性基因表达、mtDNA含量以及UCP1和p-HSL蛋白表达水平的增强。与我们对Api产热效力的发现一致，Xiong等人报道Api补充在HFD喂养小鼠中有效增强棕色特异性标志物表达与HFD对照相比，并增加冷暴露时的核心体温。虽然Xiong等人报道Api给药在肥胖小鼠中体重和脂肪组织质量显著减少，我们的结果显示Api补充对体重或脂肪组织质量无影响。这种差异可能归因于我们研究中使用正常 Chow饮食以及CL注射有效降低所有组体重的事实。然而，Api+LPS组显示食物摄入增加而无CL刺激后体重相应增加，与LPS组相比，表明Api补充后产热激活和能量耗散。未来研究中间接量热法的纳入将能够更全面评估全身能量代谢对Api补充的响应。

先前报告显示Api影响脂质代谢并减少肝脏和脂肪组织中脂质积累。在脂肪细胞培养中，TG积累在Api处理后以剂量依赖性方式减少。在肥胖小鼠中，Api处理后FFA、TG、总胆固醇和载脂蛋白B的循环水平降低。在我们LPS+CL注射小鼠中，Api补充增加脂质周转，如脂肪酸氧化和de novo合成相关基因的诱导表达所反映。我们小鼠中观察到的脂质周转激活可能与Api的褐变效应相关，因为脂质是产热的重要底物。支持这一点，ob/ob小鼠中受损产热与脂肪酸合成、动员和氧化相关基因表达减少相关，导致脂质利用减少和产热底物可用性有限。

Api对LPS注射小鼠产热的有益效应在其他脂肪库中不明显。我们观察到Api补充后LPS注射小鼠iBAT中棕色样形态、产热标志物或脂质动态无变化，可能因为BAT比其他脂肪库更抵抗炎症，除非在严重肥胖条件下。然而，在eWAT中，棕色样形态、产热标志物和脂质周转都被Api在LPS注射小鼠中抑制。Api的库特异性响应与先前研究中从iWAT和eWAT分离的原代脂肪细胞的发现一致，这可能由eWAT比iWAT更低的褐变易感性解释。eWAT中减弱的褐变响应可能归因于其与皮下脂肪相比更低的交感神经支配。而且，内脏脂肪表现出更显著的促炎特征和减少的血管生成能力与皮下库相比。这些差异可能有助于eWAT对Api诱导产热和脂质周转在炎症条件下响应性降低。

BMAT是位于骨表面附近的独特脂肪库。BMAT响应全身能量代谢变化并在骨骼生物学中扮演多样调节角色。在当前研究中，检查了Api补充后BMAT的变化。结果显示Api补充在经历CL产热刺激的LPS注射小鼠中诱导BMAT积累。尽管这些小鼠中BMAT诱导，但胫骨中成骨标志物表达无变化且骨微结构参数无显著改变。这种BMAT增加在Api对外周脂肪库影响方面的确切作用仍有待阐明。然而，我们的发现表明Api对BMAT积累的效应似乎独立于其对LPS注射小鼠iWAT褐变的影响，因为Api单独处理（无LPS和CL）也增加BMAT积累。

黄酮类化合物可以通过几种机制调节间充质干细胞的自我更新和成骨分化潜能。这些包括激活信号通路如Wnt/β-catenin、ERK和PI3K/Akt，以及调节骨特异性标志物和转录因子。此外，它们众所周知的抗氧化和抗炎特性可能进一步有助于其成骨效应。多条证据表明Api对骨代谢有积极影响。在OVX小鼠中，Api减少小梁骨丢失而不改变皮质骨丢失。在肥胖小鼠中，Api补充21天增加小梁骨体积比。而且，Api已被鉴定为人类骨髓基质干细胞成骨分化的增强剂。这种成骨效应甚至在来自老年女性参与者的细胞和器官型胚胎股骨培养的离体处理中观察到。与这些发现一致，当前研究证明Api处理单独诱导骨微环境中脂肪生成和成骨标志物，表明对骨髓细胞分化的双重调节效应。然而，尽管这些小鼠中成骨基因表达上调，小梁或皮质骨参数未观察到显著变化，可能由于Api补充相对短持续时间，可能不足以引起骨组织中可检测结构变化。

5 结论

本研究调查了Api在预防LPS诱导炎症对iWAT褐变负面影响中的作用。此外，评估了Api诱导褐变与骨微环境变化之间的关系。结果显示Api减轻炎症并促进iWAT褐变。此外，Api在用CL处理的LPS注射小鼠中促进BMAT积累而不不利影响小梁或皮质骨参数。本研究的局限性包括缺乏能量消耗的直接测量、缺乏骨强度的功能评估以及缺乏Api补充的长期测试，特别是在骨代谢方面。而且，使用非肥胖模型可能限制我们发现在肥胖背景下的生理相关性。未来研究应包括雄性和雌性小鼠以评估潜在性别特异性响应并增强转化相关性。还建议进行剂量反应实验以更好表征Api的治疗范围。尽管有这些局限性，本研究提供了关于Api在活动性炎症条件下减少炎症和促进适应性产热的治疗潜力的重要见解。然而，需要进一步研究以评估Api补充在人类中的转化相关性和治疗潜力。