内源性谷氨酸能递质系统通过TGF-β/Smad通路介导缺氧诱导的心脏成纤维细胞胶原合成

《Frontiers in Cardiovascular Medicine》：The endogenous glutamatergic transmitter system promotes collagen synthesis in cardiac fibroblasts under hypoxia

本研究发现缺氧条件下心脏成纤维细胞(CFs)分泌的L-谷氨酸水平显著升高，首次证实内源性谷氨酸能递质系统(包括谷氨酸受体iGluRs、转运蛋白SLC1A3和代谢酶GLS)在CFs中功能性表达。研究通过药理学阻断(CNQX/MK-801)证实L-谷氨酸通过激活TGF-β/Smad信号通路促进胶原合成，为心肌纤维化(MF)的发病机制提供了新见解，提示靶向谷氨酸能系统可能是治疗MF的新策略。

　　

引言

心肌纤维化(MF)是多种心脏疾病发展的共同病理基础，其特征是心脏成纤维细胞(CFs)过度活化导致细胞外基质(ECM)异常沉积。缺氧作为MF的关键致病因素，能够诱导CFs产生异常的生物学反应。虽然CFs对缺血缺氧高度敏感，并能分泌多种生物活性物质调控MF进程，但缺氧诱导CFs活化的具体分子机制尚未完全阐明。

代谢组学为揭示局部和系统水平的代谢特征改变提供了强大工具。在缺氧条件下，CFs合成和分泌的生物活性代谢物会发生显著改变，这些改变可能对细胞功能产生直接或间接的调控作用。L-谷氨酸作为中枢神经系统中最重要的兴奋性神经递质，通过激活离子型谷氨酸受体(iGluRs)和代谢型谷氨酸受体(mGluRs)调节细胞内信号转导。近年研究发现，谷氨酸在心血管系统中也发挥重要调节作用，但谷氨酸能递质系统在CFs中的表达和调节作用尚未被探索。

材料与方法

研究通过结扎SD大鼠左前降支冠状动脉建立心肌梗死(MI)模型，采用TTC染色鉴定梗死心肌区域。从新生SD大鼠心脏中分离CFs，通过差速贴壁法进行纯化。为模拟缺氧环境，将CFs置于1% O₂的低氧培养箱中培养，并使用Image-IT? Green Hypoxia Reagent验证缺氧模型的成功建立。

实验采用非靶向代谢组学技术分析CFs培养上清液中的代谢物变化，通过液相色谱-质谱联用(LC-MS)系统进行检测。使用CNQX(AMPA/海人酸受体拮抗剂)和MK-801(NMDA受体拮抗剂)阻断iGluRs活性。通过Western blot、免疫荧光、RT-PCR、ELISA等技术检测相关蛋白和基因表达水平，使用Fluo-4 AM荧光染料检测细胞内钙离子浓度。

结果

缺氧刺激CFs胶原合成

研究发现缺氧处理12小时后，CFs出现明显的形态学改变，包括细胞伸长、纺锤形形态转变以及细胞周围过度的ECM沉积。Western blot分析显示，Collagen I和Collagen III蛋白水平随时间推移逐渐上调，在缺氧12小时时表达达到峰值。免疫荧光染色进一步证实缺氧显著增强了Collagen I和Collagen III的荧光强度。值得注意的是，缺氧并未引起α-SMA表达的显著变化，表明缺氧主要促进CFs的胶原合成功能，而不影响其向肌成纤维细胞表型转化。

非靶向代谢组学分析揭示缺氧诱导CFs分泌物中L-谷氨酸水平上调

代谢组学分析鉴定出44种差异表达代谢物，其中27种在缺氧组上调，17种下调。主成分分析(PCA)显示组间代谢谱存在明显分离。层次聚类分析表明L-谷氨酸在缺氧组显著上调。KEGG通路富集分析显示差异代谢物主要富集在精氨酸和脯氨酸代谢通路。对前10个最显著改变的代谢物进行定量分析，均显示P值<0.001的统计学差异。

谷氨酸能递质系统在缺氧诱导的CFs和MI大鼠心肌组织中激活

ELISA检测证实缺氧组CFs培养上清液中L-谷氨酸浓度(280.54 ng/ml)显著高于常氧组(148.71 ng/ml)。在MI大鼠模型中也发现梗死边缘区心肌组织L-谷氨酸水平明显升高。通过琼脂糖凝胶电泳首次证实SLC1A3、GRIA3、GRIN2、GRIK5和GLS基因在CFs中相对高表达。RT-PCR和Western blot分析进一步显示缺氧上调了SLC1A3、GRIA3、GRIN2和GLS的mRNA和蛋白表达水平。

外源性L-谷氨酸在常氧条件下促进CFs胶原合成

CCK-8实验表明0.1-5 mM浓度的L-谷氨酸对CFs活力无显著影响。Western blot显示L-谷氨酸剂量依赖性地上调Collagen I和Collagen III蛋白表达，而对α-SMA表达影响较小。这些结果证实L-谷氨酸能够有效促进CFs胶原合成，且不引起明显的细胞毒性。

L-谷氨酸通过TGF-β/Smad信号通路激活缺氧条件下的CFs

使用CNQX和MK-801阻断iGluRs可显著抑制缺氧诱导的Collagen I和Collagen III蛋白上调。钙离子检测显示缺氧导致CFs胞内钙离子积累，而iGluRs拮抗剂可降低缺氧刺激的CFs内钙水平。Western blot分析表明缺氧激活了TGF-β/Smad信号通路，表现为TGF-β蛋白水平升高和p-Smad2/3与Smad2/3比值增加。免疫荧光染色显示p-Smad2/3主要定位于细胞核，且其荧光强度在缺氧条件下显著增强，这一效应可被CNQX和MK-801预处理抑制。

讨论

本研究通过非靶向代谢组学分析首次证实缺氧条件下CFs分泌的L-谷氨酸水平显著升高。研究发现谷氨酸能递质系统关键组分在CFs中功能性表达，且在缺氧条件下被激活。药理学阻断iGluRs可通过调节TGF-β/Smad信号通路抑制L-谷氨酸诱导的胶原合成。

缺氧通过激活HIF-1α进而调控VEGF、TGF-β和CTGF等靶基因表达，这些因子均已知可促进成纤维细胞活化和ECM产生。本研究观察到缺氧引起CFs形态学改变和胶原合成增加，但与既往研究不同的是，在无血清培养条件下缺氧并未引起α-SMA表达显著变化，这可能与实验条件差异有关。

代谢组学分析发现差异代谢物主要富集于精氨酸和脯氨酸代谢通路，L-谷氨酸作为这些代谢通路的关键前体物质，在维持氮平衡、能量产生和重要分子生物合成中发挥核心作用。研究发现MI患者血浆和心肌组织中L-谷氨酸水平升高，与本研究结果一致。

关于作用机制，谷氨酸通过iGluRs激活引起钙离子内流，钙离子作为重要的第二信参与调控细胞内信号级联反应。研究证实缺氧增强谷氨酸诱导的钙内流，而TGF-β/Smad信号通路的激活与细胞内钙动力学密切相关，这可能是谷氨酸调控TGF-β/Smad通路的潜在机制。

结论

本研究证实缺氧升高CFs分泌的L-谷氨酸水平，抑制iGluRs可通过调节TGF-β/Smad信号通路减轻缺氧诱导的胶原合成。这些发现突出了谷氨酸能递质系统在缺氧诱导CFs活化中的关键作用，为MF的治疗策略提供了新的理论依据。