发酵乳酸杆菌HHL-5与柠檬酸复合发酵对凋萎王草青贮品质及有氧稳定性的协同改善作用

《Frontiers in Veterinary Science》：Effects of compound fermentation with Limosilactobacillus fermentum HHL-5 and citric acid on wilted king grass silage

本研究探讨了发酵乳酸杆菌（Limosilactobacillus fermentum）HHL-5单独及其与柠檬酸复合添加对凋萎王草青贮发酵品质、微生物群落和有氧稳定性的影响。结果表明，复合添加（LCA组）能显著提升粗蛋白含量、乳酸和乙酸产量，降低氨态氮水平，并优化微生物结构（如提高乳酸杆菌相对丰度，降低肠杆菌目丰度），从而更有效地改善青贮品质与有氧稳定性，为优质王草青贮生产提供了理论依据。

　　

引言

近年来，随着反刍动物养殖规模的迅速扩大，对粗饲料的需求显著增加。优质粗饲料的供应对于推进草饲畜牧业至关重要，而青贮饲料是保障全年饲料供应的实用方法。王草（Pennisetum purpureum × P. glaucum）是禾本科杂交种，由象草（P. purpureum，2n = 28）和珍珠粟（P. glaucum，2n = 14）属间杂交而来，继承了双亲的优良性状，被广泛认为是“顶级高产牧草”之一。其卓越的生物量生产力、广泛的适应性和多样的应用，使其成为热带和亚热带地区重要的经济和生态资源。然而，王草直接青贮时品质较差，因此需要添加适当的添加剂以改善保存效果。青贮添加剂主要分为两类：发酵促进剂和抑制剂。发酵促进剂主要通过乳酸菌（LAB）增强发酵过程，主要包括可发酵底物（如糖和糖蜜）、酶制剂和特定细菌接种剂。发酵抑制剂则通过提高酸度、降低青贮饲料pH值来抑制有害微生物的增殖，常见抑制剂包括醛类、盐类、酸碱物质等无机化合物，以及甲酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸等有机酸。

在畜禽生产中，低剂量抗生素的使用往往难以避免，但其在动物饲料中的广泛应用导致了一系列不利后果，如抗生素耐药性、食品中的药物残留以及环境污染。因此，选择合适的青贮添加剂对于提高饲料质量和减轻这些负面影响至关重要。在此背景下，乳酸菌对青贮发酵至关重要，它们产生的有机酸能迅速降低pH值，缩短发酵时间，改善饲料适口性，并减少饲料中的营养损失。在各种乳酸菌中，发酵乳酸杆菌（Limosilactobacillus fermentum）尤为突出。与普通乳酸菌不同，发酵乳酸杆菌菌株对酸性和胆汁条件具有高度耐受性，这使其非常适合青贮发酵。研究表明，丙酸+植物乳杆菌（Limosilactobacillus plantarum）+发酵乳酸杆菌的组合，以及丙酸+发酵乳酸杆菌的组合在改善青贮发酵品质方面特别有效。此外，丙酸+发酵乳酸杆菌的组合在降低有氧暴露后酵母和霉菌生长方面显示出卓越潜力，是改善青贮保存的有效方法。然而，关于使用发酵乳酸杆菌作为添加剂的研究有限，大多数研究集中在植物乳杆菌上。柠檬酸就是这样一种有前景的添加剂，与甲酸或乙酸等其他常用酸相比，它被认为更安全、更温和。柠檬酸不仅能提高饲料效率、动物健康和生产力，而且成本效益高，易于通过微生物发酵生产。研究表明，添加苹果酸或柠檬酸，结合植物乳杆菌，可以改善苜蓿青贮的发酵品质、限制蛋白质水解并增强其脂肪酸组成。柠檬酸还能抑制不良微生物，并与乳酸菌协同作用以提升青贮品质。

基于此，本研究旨在评估四个处理组王草青贮的理化性质：无添加剂（CK）、添加柠檬酸（CA）、添加发酵乳酸杆菌HHL-5（L）以及添加发酵乳酸杆菌和柠檬酸复合发酵（LCA）。采用高通量测序分析这些青贮组中的微生物群落，以更深入地了解不同条件如何影响细菌种群。此外，还测量了青贮饲料的有氧稳定性和保质期，这些发现为优质王草青贮的研究和生产提供了坚实的理论基础。

材料与方法

发酵乳酸杆菌HHL-5与柠檬酸

发酵乳酸杆菌HHL-5分离自海南大学食品科学与工程学院食品生物技术实验室。

柠檬酸购自中国医药集团总公司（国药集团化学试剂有限公司）。

王草样品采集

王草（热研4号）采集自中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 Montenegrin 羊养殖场。将采集的王草切碎成2–5厘米的段。切碎后，将草转移到无菌袋中并运送到实验室，在48小时内风干至水分含量低于65%。选择连续7天无降水的时间段进行采样，采样时间为2022年11月。

王草青贮制备与分组

实验设计包括四组，如表1所示。分组如下：CK（无添加剂）、CA（添加柠檬酸）、L（添加发酵乳酸杆菌HHL-5）和LCA（添加0.1%发酵乳酸杆菌HHL-5和0.15%柠檬酸）。每组设三个重复，密封青贮在室温、避光条件下储存。青贮温度为30°C。

王草青贮成分分析

王草营养成分分析：干物质（DM）含量根据GB/T6435-2014《饲料中水分的测定》测定。粗蛋白含量采用凯氏定氮法测定王草青贮。酸性洗涤纤维（ADF）含量根据NY/T 1459-2022《饲料中酸性洗涤纤维的测定》测定。中性洗涤纤维（NDF）含量根据GB/T 20806–2022《饲料中中性洗涤纤维（NDF）的测定》测定。可溶性碳水化合物（WSC）含量采用蒽酮比色法测定。

青贮发酵品质测定：青贮pH值测定：在每个指定采样时间打开各组的青贮袋，混合上层样品。取10克混合青贮样品转移到150毫升无菌锥形瓶中，加入90毫升无菌水。搅拌至样品完全浸没后密封。振荡24小时后过滤分离固体残渣，获得浸出液。部分浸出液用于pH计测量pH值，其余部分储存在无菌离心管中。有机酸含量测定：使用高速离心机在10,000 rpm下离心制备的青贮样品上清液10分钟以获得上清液。用一次性注射器吸取提取液，并通过0.22微米纤维素膜（有机型）过滤以去除杂质。用10微升注射器小心吸取过滤后的样品，确保注射器内无气泡。使用高效液相色谱法（HPLC）分析样品。氨态氮含量采用苯酚-次氯酸盐法测定。

王草青贮细菌组成测序

王草微生物基因组DNA提取：对于每组王草青贮，称取25克样品，与225毫升无菌水混合，并在摇床中孵育2小时。过滤青贮残渣，离心滤液15分钟收集沉淀。然后使用CTBA法从王草青贮样品中提取微生物基因组DNA。

PCR扩增与测序：对从王草青贮中提取的细菌DNA进行PCR扩增。PCR引物的序列信息见表2，PCR反应体系详见表3。扩增产物随后送至广东美格基因科技有限公司进行测序。

生物信息学与数据分析：基于测序公司提供的有效数据和OTU注释表，使用R软件分析界、门、纲、目、科、属、种水平的群落组成。使用OTU相对丰度表和usearch（V10）中的alpha_div命令进行Alpha多样性分析。使用自定义Python脚本（Python v2.7）绘制稀释曲线和Rank Abundance曲线。使用R中的prcomp函数进行PCA分析，并使用R中的vegan包生成PCoA图。使用GraPhlAn软件提取研究样本的物种组成和相对丰度信息。本研究的测序数据已提交至美国国家生物技术信息中心序列读段存档数据库，Bioproject登录号为PRJNA1333438。

王草青贮有氧稳定性测定

青贮发酵30天后，打开样品袋，混合，并在室温下放置。在开封后72、144和216小时测量pH值，根据pH变化评估有氧稳定性。

数据处理与分析

实验数据在Excel 2020中处理。使用SPSS 26进行方差统计分析。使用Origin 2017绘制图表。细菌和真菌群落测序数据由Illumina HiSeq测序平台生成。

结果

王草青贮营养成分分析

表4展示了不同处理组王草青贮的营养成分。青贮30天后，与青贮前相比，四个处理组的干物质（DM）含量无显著差异（p > 0.05）。LCA组的DM含量显著高于L组和CA组（p < 0.05）。青贮30天后，CK组的粗蛋白含量较青贮前显著下降（p < 0.05），而L、CA和LCA组的粗蛋白含量未观察到显著变化（p > 0.05）。LCA组的粗蛋白含量显著高于CK组（p < 0.05）。然而，LCA、L和CA组之间无显著差异（p > 0.05）。此外，L组和CA组的粗蛋白含量之间也无显著差异（p > 0.05）。这一结果表明，单独添加柠檬酸或发酵乳酸杆菌并不能减少青贮过程中粗蛋白的损失，而联合使用两种添加剂则能有效降低粗蛋白损失。青贮30天后，所有四个处理组的NDF和ADF含量均显著高于青贮前水平（p < 0.05）。四个处理组之间的NDF含量无显著差异（p > 0.05）。然而，L、CA和LCA组的ADF含量显著较低，其中L组的ADF含量最低（p < 0.05）。青贮30天后，所有四个处理组的WSC含量均显著低于青贮前水平（p < 0.05）。WSC含量从高到低排序为：CK > L > CA > LCA。

王草青贮品质分析

不同处理组王草青贮发酵品质的动态变化如表5所示。随着青贮时间的延长，CK、L、CA和LCA四个处理组的pH值呈下降趋势。青贮第1天，L、CA和LCA三个处理组的pH值显著低于CK组（p < 0.05）。青贮30天后，CK组的pH值与L、CA和LCA三组有显著差异（p < 0.05），CK、L、CA和LCA四种青贮的最终pH值分别为4.30、4.15、4.06和3.97。表明复合添加剂能更好地降低青贮饲料的pH值。

在30天的发酵过程中，乳酸和乙酸的含量均呈现增加趋势（p < 0.05），并在第30天达到最大值，丙酸和丁酸在青贮中未检测到。青贮结束时，四种处理组（CK、L、CA、LCA）的乳酸和乙酸含量存在显著差异（p < 0.05）。LCA组表现出最高的浓度，乳酸为32.33克/千克，乙酸为16.52克/千克。单独效应分析显示，与CK相比，单独添加发酵乳酸杆菌或柠檬酸均能显著增加乳酸含量（p < 0.05）。值得注意的是，LCA组表现出协同效应，其乳酸和乙酸含量显著高于任一添加剂单独使用（p < 0.05），这确凿地证明了复合添加剂在提升发酵品质方面的卓越功效。此外，王草青贮中的氨态氮含量在发酵过程中呈现不规则变化。总体而言，CA组和LCA组的氨态氮含量显著低于CK组和L组（p < 0.05），而CK组和L组之间无显著差异（p > 0.05）。

王草青贮高通量测序

测序数据分析：原始测序数据处理后获得1,231,788条有效序列（平均每个样本102,649条），有效率超过95%。根据图1A，所有样本的测序深度覆盖了大多数微生物，满足了测序要求。Rank Abundance曲线（图1B）显示了样本的多样性，满足后续分析要求。

不同处理组王草青贮的花瓣图如图2所示。观察到的OTU数量如下：CK组620个，L组549个，CA组561个，LCA组596个。其中，CK组和LCA组的OTU数量较多。此外，图2显示核心OTU数量为405个。

Alpha多样性分析：每个样本的Alpha多样性指数如表6所示。高香农指数表示物种丰富度高，而低辛普森指数表明在多样化的微生物群落中存在优势物种。LCA组的香农指数显著高于CK组（p < 0.05），而辛普森指数显著较低（p < 0.05）。这表明联合添加发酵乳酸杆菌和柠檬酸增强了王草青贮的微生物丰富度并促进了优势物种的形成。此外，CA组的Chao 1和Ace指数显著低于CK组（p < 0.05）。然而，L组、LCA组和CK组之间的Chao 1和Ace指数无显著差异（p > 0.05）。

Beta多样性分析：Beta多样性是一种基于物种群落间距离评估样本间微生物群落差异的方法。Beta多样性分析揭示了王草青贮细菌群落组成的差异。王草青贮细菌组成差异的主坐标分析（PCoA）如图3所示。第一主成分（PCoA1）和第二主成分（PCoA2）分别占总方差的71.8%和11%。CK组和L组的细菌组成在PCoA图上位置接近，表明它们的细菌组成相似。CK组的细菌群落与CA组和LCA组明显分离，表明存在显著的组成差异，而CA组和LCA组表现出高度相似的细菌谱。总体而言，单独添加发酵乳酸杆菌并未显著改变王草青贮的细菌组成，而柠檬酸或发酵乳酸杆菌与柠檬酸的组合则显著改变了其组成。

门水平细菌群落组成分析：不同处理下王草青贮门水平细菌物种的相对丰度如图4所示。如图4所示，变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidete）和厚壁菌门（Firmicutes）是王草青贮中的优势门。CK、L、CA和LCA组中变形菌门的相对丰度分别为68.25%、71.74%、46.11%和44.27%。拟杆菌门的相对丰度分别为25.79%、21.8%、34.01%和31.06%，厚壁菌门的相对丰度分别为5.59%、5.99%、19.25%和23.1%。单独添加发酵乳酸杆菌并未显著改变凋萎王草青贮门水平的细菌组成。相比之下，添加柠檬酸（单独或与发酵乳酸杆菌联合）显著改变了细菌群落结构，其中联合处理的效果最为明显。

属水平细菌群落组成分析：不同处理下王草青贮属水平细菌物种的相对丰度如图5所示。肠杆菌属（Enterobacter）、鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium）、不动杆菌属（Acinetobacter）和乳酸杆菌属（Lactobacillus）是不同处理王草青贮中的优势属。CK、L、CA和LCA组中肠杆菌属的相对丰度分别为36.92%、40.18%、18.13%和17.44%。CK、L、CA和LCA组中鞘氨醇杆菌属的相对丰度分别为19.85%、16.60%、29.09%和23.51%。CK、L、CA和LCA组中不动杆菌属的相对丰度分别为11.14%、11.96%、11.13%和11.51%。CK、L、CA和LCA组中乳酸杆菌属的相对丰度分别为2.66%、2.65%、15.53%和18.65%。与CK组相比，CA组和LCA组中肠杆菌属的相对丰度降低，而乳酸杆菌属的相对丰度增加。在L组中，肠杆菌属的相对丰度增加，而乳酸杆菌属未显示显著变化。这表明单独添加发酵乳酸杆菌HHL-5并未显著增加王草青贮中乳酸杆菌属的相对丰度，而单独添加柠檬酸或发酵乳酸杆菌与柠檬酸联合添加则显著提高了其相对丰度。参与青贮发酵的主要细菌是乳酸菌。比较分析显示，添加乳酸菌降低了鞘氨醇杆菌属的相对丰度，而添加柠檬酸则增加了其相对丰度。数据比较表明，在凋萎王草青贮中添加发酵乳酸杆菌、柠檬酸或它们的组合并未显著改变不动杆菌属的相对丰度。此外，在王草青贮中也检测到了乳酸球菌属（Lactococcus）。

王草青贮有氧稳定性

图6展示了不同处理下王草青贮在有氧暴露期间pH值的变化。开始有氧暴露后，所有组的pH值从72小时开始上升。CK组和L组的pH值上升速率高于CA组和LCA组。有氧暴露216小时后，CK、L、CA和LCA组的pH值分别为6.68、6.92、4.51和4.35。此外，图表显示L组的有氧稳定性显著低于CK组（p < 0.05），而LCA组的有氧稳定性显著高于CA组（p < 0.05）。分析表明，单独添加发酵乳酸杆菌并未改善王草青贮的有氧稳定性，而添加柠檬酸或柠檬酸与发酵乳酸杆菌联合添加则显著增强了其有氧稳定性。

讨论

发酵乳酸杆菌和柠檬酸对王草青贮化学成分的影响

本研究表明，经过凋萎处理后，王草青贮表现出相对较高的干物质含量。青贮物料的含水量是影响青贮品质的关键因素。过多的水分会促进不良微生物的生长和增殖。研究表明，降低青贮物料的含水量有助于改善青贮品质。在本研究中，CA组和LCA组的粗蛋白含量显著高于CK组，可能是因为柠檬酸抑制了王草中粗蛋白的水解。研究表明柠檬酸可以抑制青贮饲料中粗蛋白的水解。本研究进一步证实了这一假设。L组的粗蛋白含量与CK组无显著差异，表明单独添加发酵乳酸杆菌并未抑制王草青贮中的蛋白质水解。这些发现表明，发酵乳酸杆菌和柠檬酸的组合可以有效地改善青贮饲料中的蛋白质保存。过高的NDF含量会降低反刍动物的采食量，而高ADF含量则影响消化率。在本研究中，L、CA、LCA和CK组之间的NDF含量无显著差异。然而，ADF含量存在显著差异，表明发酵乳酸杆菌和柠檬酸改善了王草青贮对反刍动物的消化率。WSC是青贮过程中乳酸菌发酵的主要能源。在本研究中，L、CA、LCA和CK组之间的碳水化合物含量存在显著差异。这些发现表明，发酵乳酸杆菌和柠檬酸不仅提高了青贮饲料的营养品质，还创造了更有利的发酵环境。

发酵乳酸杆菌和柠檬酸对王草青贮发酵品质的影响

pH值是评估青贮发酵品质的重要指标。pH水平反映了青贮饲料的质量。根据中国青贮标准，pH值在3.4–4.4之间表明青贮品质良好。在本研究中，王草青贮的pH值在此范围内，LCA组的pH值为3.97。这表明发酵乳酸杆菌和柠檬酸的联合处理有助于形成有利的发酵环境。王草青贮较低的pH值可归因于三个因素：（1）凋萎降低了水分含量，抑制了不良微生物的生长，防止了与乳酸菌的营养竞争；（2）乳酸菌的增殖加速了发酵并增加了乳酸产量，从而抑制了竞争微生物；（3）柠檬酸具有抗菌特性，其较低的pH值进一步抑制了不良微生物的生长。

有机酸是青贮品质的另一个重要指标。乳酸是青贮发酵过程的主要产物，较高的乳酸含量通常表明青贮品质较好。在本研究中，CK、L、CA和LCA组的乳酸含量存在显著差异，LCA组的乳酸含量最高，表明添加发酵乳酸杆菌可以增加乳酸含量，从而改善青贮品质。此外，研究表明适当添加柠檬酸可以促进乳酸含量的增加。本研究进一步验证了这一观点。乳酸产量的增加不仅有助于青贮饲料的整体品质，还直接影响其保存和消化率。乳酸菌发酵水溶性碳水化合物（WSC）产生乳酸，乳酸含量的增加导致pH值下降，这也是L、CA和LCA组WSC含量较低的主要原因。乙酸是热带草青贮中的主要有机酸，较高浓度的乙酸会导致pH值升高。此外，研究表明乙酸含量与青贮饲料的有氧稳定性呈正相关。L组的乙酸含量显著低于CK组，主要归因于添加的发酵乳酸杆菌驱动的高效发酵。该过程快速消耗可用的WSC产生乳酸，降低pH值，并抑制了乙酸产生菌的活性。丙酸和丁酸是青贮饲料中不良的有机酸，它们通过刺激梭菌生长破坏青贮发酵，导致营养损失和适口性降低。本研究未检测到这两种酸。氨态氮是评价青贮品质的重要指标。青贮饲料中的蛋白质被水解成氨态氮和其他物质，从而降低了饲料的营养价值和品质。在本研究中，LCA组的氨态氮含量显著低于CK组，这与青贮饲料中的粗蛋白含量结果一致。

发酵乳酸杆菌和柠檬酸对王草青贮细菌组成的影响

青贮过程是一个微生物发酵过程。高通量测序可以揭示青贮饲料中的微生物组成，并深入分析青贮过程中微生物之间的相互作用。在本研究中，LCA组显示出较低的辛普森指数，表明联合使用发酵乳酸杆菌和柠檬酸增加了王草青贮的细菌多样性，并促进了特定有益类群的优势地位。发酵乳酸杆菌和柠檬酸可能协同抑制了许多不良微生物的生长，使得乳酸菌在发酵后期成为优势微生物群。在厌氧条件下，无法适应的细菌消失，导致细菌多样性增加。主坐标分析（PCoA）结果显示，单独添加发酵乳酸杆菌并未显著改变王草青贮的细菌组成，而柠檬酸或发酵乳酸杆菌+柠檬酸处理则显著改变了其细菌组成。PCoA结果表明发酵乳酸杆菌对微生物群落结构的影响有限。CA组和LCA组之间的相似性暗示柠檬酸是影响微生物组成的主要因素。

在本研究中，王草青贮的主要细菌门是变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门。青贮后，厚壁菌门的增加和变形菌门的减少可归因于青贮饲料中的厌氧和酸性微环境，这限制了需氧微生物并促进了乳酸菌菌株的生长。单独添加发酵乳酸杆菌并未显著影响王草青贮的主要细菌门，这可能是因为凋萎处理后水分含量较低，抑制了乳酸菌的生长。这凸显了柠檬酸在驱动微生物组成发生显著变化方面的必要性。在含有柠檬酸或发酵乳酸杆菌+柠檬酸处理的组中，厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度显著增加。这一结果与之前的研究一致。肠杆菌属被认为是青贮饲料中的有害细菌，能够将乳酸转化为乙酸和其他物质。在本研究中，CK组和L组中肠杆菌属的相对丰度较高，但乙酸含量较低，可能是因为低水分含量的王草物料减少了WSC的释放，抑制了其生长和代谢。本研究表明，添加柠檬酸后肠杆菌属的相对丰度下降，这与其他研究结果一致。此外，添加柠檬酸后，乳酸杆菌属的相对丰度增加，在发酵乳酸杆菌和柠檬酸联合组中相对丰度更高。柠檬酸的添加似乎增强了乳酸杆菌的生长，同时抑制了有害细菌肠杆菌属。这种现象可能是由于乳酸菌利用柠檬酸作为发酵底物。形成的酸性环境抑制了对酸敏感微生物的生长，从而为乳酸菌生长创造了有利条件，并形成了协同效应。鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）是热带草青贮中的常见属，研究人员推测它可能是热带青贮的特征属。由于其降解生物胺的能力，鞘氨醇单胞菌属被认为是热带草青贮中的有益细菌。不动杆菌属是一种需氧细菌，但研究表明它可以在含有乙酸的厌氧条件下存活。我们之前的研究也检测到了不动杆菌属的存在。本研究表明，添加发酵乳酸杆菌和柠檬酸并未抑制不动杆菌属的生长。

发酵乳酸杆菌和柠檬酸对王草青贮有氧稳定性的影响

有氧稳定性是指青贮饲料在发酵完成后抵抗空气暴露而腐败的能力。青贮饲料的有氧变质会影响饲喂效果，严重时可能损害畜禽健康。有氧变质主要由需氧微生物、酵母、霉菌和其他微生物引起。乙酸可以抑制酵母生长，从而缓解青贮饲料的有氧腐败。在本研究中，CA组和LCA组表现出更好的有氧稳定性，主要归因于其较高的乙酸含量。暴露于空气后，乙酸抑制了一些有害微生物的生长。本研究中添加的乳酸菌是发酵乳酸杆菌，属于异型发酵乳酸菌。然而，研究表明单独添加发酵乳酸杆菌未能改善青贮饲料的有氧稳定性。造成这种现象的可能原因是过度凋萎处理导致水分含量过低，不仅抑制了不良微生物的生长，也抑制了发酵乳酸杆菌的生长和代谢。

结论

在本研究中，将发酵乳酸杆菌HHL-5与柠檬酸组合作为青贮添加剂添加到王草青贮中。然而，单独添加发酵乳酸杆菌对改善凋萎王草青贮品质的效果有限，因为低水分含量（<65%）抑制了发酵乳酸杆菌的生长和代谢。此外，结果表明，使用发酵乳酸杆菌联合柠檬酸进行青贮可以显著改善凋萎王草青贮的品质。单独添加发酵乳酸杆菌到凋萎王草中对王草青贮的微生物组成没有显著影响。然而，使用柠檬酸进行青贮显著改变了微生物组成，增加了细菌多样性，提高了乳酸杆菌属的相对丰度，并降低了肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的相对丰度。在凋萎王草青贮中，单独添加发酵乳酸杆菌不能改善有氧稳定性，而使用柠檬酸进行青贮则显著增强了其有氧稳定性。