槲皮素通过MDM2/p53通路增强自噬改善β1-AA诱导的心力衰竭

《Frontiers in Nutrition》：Quercetin reverses β1-adrenoceptor autoantibody-induced heart failure by promoting MDM2-mediated ubiquitination and degradation of p53 in cardiomyocytes

本研究发现中药芪苈强心胶囊的关键成分槲皮素可通过调控MDM2/p53信号轴逆转β1-AA（β1-肾上腺素能自身抗体）诱导的心肌细胞自噬抑制。研究通过网络药理学筛选出槲皮素为核心活性成分，实验证实其通过上调E3泛素连接酶MDM2表达，促进p53蛋白泛素化降解，从而解除p53对自噬的抑制作用，改善心脏功能与纤维化。该研究为自身免疫相关心力衰竭提供了新的治疗靶点和理论依据。

　　

GEO数据库分析揭示心力衰竭患者心肌组织中自噬相关通路显著富集

通过对基因表达汇编（GEO）数据库中三个基因表达微阵列数据集（GSE5406、GSE57338、GSE3586）进行整合分析，构建了一个包含385名心力衰竭患者和164名健康对照的队列。差异表达分析共鉴定出213个显著差异表达基因（DEGs），其中109个显著上调，104个显著下调。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析结果显示，这些DEGs在自噬相关通路中显著富集，包括吞噬体、溶酶体、线粒体自噬（mitophagy）和mTOR信号通路。这些发现提示，心肌组织中的自噬失调可能参与人类心力衰竭的发病过程。

槲皮素是芪苈强心胶囊中上调自噬的关键活性成分

通过网络药理学分析芪苈强心胶囊（由人参、黄芪、附子、泽泻、丹参、红花、葶苈子、桂枝、陈皮、玉竹、香加皮等11味中药组成）中调控自噬改善心力衰竭的关键成分。从中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）获取芪苈强心胶囊的活性成分及其对应蛋白靶点。通过检索多个在线数据库（DisGeNET、TTD、DrugBank）整合得到265个心力衰竭相关靶点。将这265个心力衰竭相关靶点与自噬相关基因取交集，获得81个自噬相关基因。进一步分析这81个自噬相关基因对应的活性成分，发现槲皮素所占比例最高。细胞实验表明，槲皮素在100 μM浓度下能显著减轻β₁-AA诱导的H9c2心肌细胞死亡。

槲皮素逆转β₁-AA诱导的小鼠心肌纤维化和心功能不全

通过用β₁-肾上腺素能受体细胞外第二环肽段（β₁-AR-ECII）主动免疫小鼠四周建立心力衰竭模型，治疗组同时每日腹腔注射100 mg/kg槲皮素。超声心动图评估显示，β₁-AA组小鼠出现明显心功能不全，表现为左心室收缩末期内径（LVIDs）、左心室舒张末期内径（LVIDd）、收缩末期容积（ESV）和舒张末期容积（EDV）增加，以及射血分数（EF）和短轴缩短率（FS）降低。槲皮素治疗能显著逆转这些异常的心功能指标。Masson染色显示，β₁-AA组小鼠心肌间质有明显的胶原沉积，而槲皮素治疗显著减轻了这种病理性的纤维化改变。此外，β₁-AA显著上调了心力衰竭标志物心房钠尿肽（Anp）和脑钠尿肽（Bnp）的mRNA表达，槲皮素治疗有效抑制了这些标志物表达的升高。

槲皮素逆转β₁-AA诱导的心肌细胞自噬水平下降

在β₁-AA阳性小鼠的心脏组织中，槲皮素腹腔注射显著增加了微管相关蛋白1轻链3（LC3）-II蛋白和LC3 mRNA水平，并减少了自噬底物p62的积聚。在H9c2细胞中，用100 μM槲皮素预处理4小时，再暴露于β₁-AA 24小时，可增加LC3-II水平并降低p62水平。免疫荧光分析显示，在β₁-AA刺激后，经槲皮素预处理的心肌细胞中LC3斑点数量多于单独β₁-AA处理组。这些结果共同表明，槲皮素增强了自噬流，减轻了β₁-AA诱导的自噬功能受损。

槲皮素通过降低p53蛋白表达逆转β₁-AA诱导的心肌细胞自噬减少

利用STRING数据库构建槲皮素相关靶点的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并通过Cytoscape可视化，CytoHubba算法鉴定出p53为关键枢纽基因。体内外实验验证显示，免疫4周后，小鼠心肌组织中p53蛋白水平显著升高，而槲皮素治疗显著抑制了β₁-AA诱导的p53蛋白上调。细胞模型中也得到一致结果。免疫荧光显示β₁-AA处理的细胞p53荧光强度显著增加，槲皮素处理有效逆转了β₁-AA诱导的信号增强。慢病毒介导的p53敲低实验表明，p53敲低减轻了β₁-AA诱导的LC3-II蛋白和mRNA水平下降以及p62积聚。在p53过表达的细胞中，槲皮素对自噬水平的恢复作用明显减弱，表明p53是槲皮素调控自噬所必需的。值得注意的是，槲皮素显著降低了心肌细胞中p53蛋白水平，但未改变p53 mRNA水平，提示槲皮素可能是在翻译后水平通过促进p53蛋白降解来调控其表达。

槲皮素逆转β₁-AA诱导的心肌细胞p53泛素化水平下降

基因本体（GO）功能富集分析显示，槲皮素靶向蛋白显著富集于泛素化相关通路。使用蛋白质合成抑制剂放线菌酮（CHX）的实验表明，槲皮素显著提高了p53蛋白的降解速率。进一步对p53泛素化水平的分析表明，与对照组相比，β₁-AA处理降低了心肌细胞中p53的泛素化水平，而槲皮素能显著逆转这一现象。

槲皮素逆转β₁-AA诱导的心肌细胞MDM2蛋白水平下调

分子对接模拟分析表明，经典的E3泛素连接酶MDM2（小鼠双微体同源基因2）与槲皮素具有结合能力，结合能<-6.9 kcal·mol^-1。分子动力学模拟显示复合物结构相对稳定。实验验证表明，在主动免疫小鼠模型中，槲皮素腹腔注射显著逆转了β₁-AA诱导的心肌组织MDM2蛋白水平下调。在H9c2心肌细胞中，β₁-AA处理24小时后，MDM2蛋白和mRNA水平显著降低，而槲皮素预处理4小时能显著提高MDM2蛋白和mRNA水平。使用MDM2特异性抑制剂Nutlin-3a处理后，槲皮素对p53蛋白降解的作用减弱，其逆转β₁-AA诱导的自噬水平下降的能力也受到削弱。这表明槲皮素是通过增加MDM2蛋白表达来逆转心肌自噬的抑制。

综上所述，槲皮素通过上调MDM2表达，促进p53的泛素化和降解，从而解除p53对心肌细胞自噬的抑制作用，最终恢复自噬流，对β₁-AA诱导的心力衰竭发挥心脏保护作用。该研究阐明了槲皮素改善心力衰竭的一种新分子通路，为治疗自身免疫相关的心力衰竭提供了有前景的策略。