新型β-环糊精-舒昔布宗偶联物在蛋白酶体调控中的潜力探索

《ChemMedChem》：Unveiling the Potential of a New β-Cyclodextrin-Suxibuzone Conjugate in Proteasome Regulation

本文报道了一种新型β-环糊精-舒昔布宗（Suxibuzone, SB）偶联物（SB-CD）的设计、合成及其在调控20S蛋白酶体（20S proteasome）活性方面的卓越表现。研究证实，SB-CD能以剂量依赖方式显著增强纯化人20S核心颗粒及分化人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞（dSH-SY5Y）中蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样（Chymotrypsin-like, Ch-L）和胰蛋白酶样（Trypsin-like, T-L）活性，其EC50值（Ch-L: 0.6 ± 0.1 μM; T-L: 1.1 ± 0.3 μM）远优于单独使用的舒昔布宗。该偶联物能有效进入细胞并保持稳定，降低细胞内泛素化蛋白积累，展现出治疗蛋白酶体相关疾病（如神经退行性疾病）的巨大潜力。

　　

1 引言

蛋白酶体是一种多亚基酶复合物，在维持细胞内蛋白质质量控制方面发挥着核心作用，其功能失调与多种疾病密切相关，特别是神经退行性疾病和癌症等蛋白质病（Proteinopathies）。蛋白质病是指由蛋白质稳态（Proteostasis）失衡引起的疾病，导致蛋白毒性应激和细胞信号转导及代谢改变。蛋白酶体激活被认为有助于清除导致神经元损伤的异常蛋白质聚集体。

近年来，吡唑啉酮类化合物作为蛋白酶体激活剂显示出治疗潜力。舒昔布宗（Suxibuzone, SB）是苯丁唑酮的前体药物，属于吡唑啉酮家族，是一种广泛使用的非甾体抗炎药。然而，其临床应用常因溶解性差、生物利用度低和胃肠道副作用而受限。将药物与环糊精（Cyclodextrin, CD）等生物分子偶联是改善药理特性和降低毒性的有效策略。

环糊精是由1,4-连接的吡喃葡萄糖单元组成的环状寡糖，具有疏水空腔和亲水外表面，能与多种客体分子形成包合物，从而改善难溶性药物的溶解性、稳定性和生物利用度。除了包合作用，共价偶联已成为改善多种难溶性药物药代动力学和治疗特性的有前景的方法。共价偶联物通过稳定的化学键将药物与环糊精衍生物连接，可提高溶解度、实现控制释放和靶向递送，从而减少给药频率并最小化药物副作用。

本研究设计并合成了舒昔布宗的新型环糊精偶联物（SB-CD），该合成涉及SB与3A-氨基-3A-脱氧-(2AS, 3AS)-β-环糊精（βCD3NH₂）通过酰胺键进行偶联。为了更好地与CD衍生物比较并排除因缺少羧基（COOH）而导致行为差异的可能性，还合成了SB的酰胺衍生物（SB-ETA）。研究评估了SB-CD对纯化20S核心颗粒和分化神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞裂解物中蛋白酶体活性的影响，证实SB-CD能显著增强蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样和胰蛋白酶样蛋白水解活性。质谱研究证实了新型偶联物的细胞内化，表明SB-CD作为一种有效的蛋白酶体调节剂具有广阔的应用前景。

2 结果与讨论

2.1 合成与表征

新型偶联物SB-CD以βCD3NH₂和SB为起始原料，在EDC和HOBt存在下合成。最终产物通过核磁共振（NMR）和高分辨质谱（HR MS）进行表征。在核磁共振氢谱（¹H NMR）中，可以观察到SB部分苯环的芳香区信号以及丁烯和琥珀酰链的脂肪区信号。在CD的H-1区，可以识别出功能化A环在4.77 ppm处的信号。二维谱图证实了CD被SB功能化。旋转帧奥弗豪泽效应光谱（ROESY）谱图中观察到SB部分芳香质子与CD的H-3和H-5之间的相关峰，表明苯环与CD空腔存在相互作用。

SB-ETA也通过缩合反应合成，并通过NMR谱图和HR MS进行表征。谱图中除了SB部分的信号外，还可以找到乙醇胺（ETA）链的存在。

2.2 对纯化人20S核心颗粒蛋白酶体活性的影响

蛋白酶体的三种主要催化功能中，胰凝乳蛋白酶样（Ch-L）活性最为普遍，占据了蛋白酶体大部分降解能力，对于分解长寿命和调节蛋白至关重要，直接影响增殖、凋亡和细胞应激反应等基本过程。

在浓度范围50 nM至50 μM内，测量了h20S（1.5 nM）对7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）合成底物的三种蛋白水解活性。SB-CD对蛋白酶体功能表现出选择性调节作用，主要针对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性。结果表明，SB-CD诱导20S对荧光底物的切割动力学显著增强（约200%）。胰蛋白酶样活性分析显示明显的剂量依赖性增加，浓度从0.5增加到20 μM时，活性水平相较于对照值上升至约120%–125%。相反，在相同条件下， caspase样（Caspase-like, C-L）活性基本保持不变。这种选择性激活表明SB-CD可能通过变构机制发挥作用，优先改变控制碱性残基切割的构象状态。

通过剂量反应非线性拟合计算EC₅₀值。SB-CD对Ch-L活性的EC₅₀值为0.6 ± 0.1 μM，对T-L活性为1.1 ± 0.3 μM。这些值显著低于SB单独使用的值（Ch-L: 4.4 ± 0.4 μM; T-L: 4.3 ± 0.5 μM）。为了排除增强的激活效应是由于缺少游离羧基引起的可能性，比较了SB-ETA在5和10 μM浓度下与相同浓度SB的Ch-L、T-L和C-L活性。由于SB-ETA的溶解性比舒昔布宗差，限制了可测试的浓度。结果表明，两种测试化合物具有与舒昔布宗相似的活性，无统计学显著差异。

研究证实，在相同浓度范围内，游离环糊精不影响蛋白酶体活性。相应的SB + CD混合物（比例1:1）在所有实验中用作对照，并计算了其Ch-L活性的EC₅₀值。与CD的共价结合增强了化合物的有效性，表明其与生物靶点的相互作用更有利，或者与简单物理混合物相比，活性药物的稳定性/浓度得到改善。

2.3 对SH-SY5Y细胞裂解物蛋白酶体活性的刺激作用

在纯化人20S蛋白酶体上观察到的有希望的结果，促使研究者探究在存在所有可能的生理蛋白酶体识别基序的细胞裂解物中，激活作用是否仍然可检测。为了排除测试化合物的任何细胞毒性作用，在完全分化的SH-SY5Y细胞系上进行了MTT实验。该神经元样模型也用于分析偶联物对细胞裂解物中20S活性的影响。

数据显示，SB-CD以剂量依赖方式显著增强蛋白酶体活性，在10 μM浓度下观察到最高活性。相比之下，SB也增加活性，但程度低于偶联物。星号表示的统计学显著性表明，观察到的差异非常显著，尤其是在SB-CD较高浓度下。

在SH-SY5Y细胞裂解物中观察到的蛋白酶体活性增加尤其值得注意。这表明SB-CD可以在细胞环境中有效增强蛋白酶体功能。这至关重要，因为它提示SB-CD可以在活细胞中调节蛋白酶体活性，这是其治疗应用的关键因素。

2.4 对细胞培养中泛素化蛋白积累的影响

通过评估处理后泛素化蛋白的水平，进一步探索了在SH-SY5Y细胞裂解物中通过荧光底物揭示的蛋白酶体活性增加。泛素化蛋白的积累表明降解受损或对蛋白酶体的需求增加，而其减少则表明活跃的蛋白酶体降解。

为了测试SB-CD化合物是否能诱导多聚泛素化蛋白减少，在分化SH-SY5Y（dSH-SY5Y）裂解物中评估了用该偶联物处理6小时后的水平，该浓度（10 μM）在体外试验中表现出最高的胰凝乳蛋白酶活性。

蛋白质印迹分析显示，与对照相比，SB-CD导致抗泛素抗体信号减少。值得注意的是，这种减少比未修饰的舒昔布宗观察到的更为明显。相反，正如预期，用Bortezomib处理导致泛素化蛋白增加，这与蛋白酶体抑制一致。

2.5 液相色谱-质谱（LC-MS）研究

为了评估SB-CD穿过质膜的能力，使用了液相色谱和高分辨电喷雾电离质谱（HR-ESI-MS）。用于LC-MS分析的样品来自用SB-CD或SB（10 μM）处理的完全分化的SH-SY5Y细胞的裂解物。未处理细胞的裂解物也作为阴性对照进行检查。

报告的提取离子色谱图（XIC）表明在用SB处理的细胞裂解物中存在SB。对来自未处理细胞（对照）的样品的分析显示在相同的保留时间（RT, 19.6分钟）存在一个色谱峰。然而，对应于观察到的峰的质谱图仅显示痕量的SB，来自色谱优化过程中注入柱子的标准化合物的残留量。即使在几次连续的空运行后仍能检测到SB信号，这可归因于分子的疏水性和质谱分析中应用的采集方法（靶向SIM）的高灵敏度。有趣的是，对用SB-CD处理的分化SH-SY5Y细胞获得的样品的LC-MS分析揭示了一个对应于SB偶联物的信号，表明SB-CD具有跨膜能力。

在不同孵育时间通过LC-MS分析来自暴露于SB或SB-CD化合物的分化SH-SY5Y的细胞裂解物，以评估SB-CD分子的稳定性。未使用蛋白酶抑制剂以保留酶促蛋白水解活性。样品在37°C孵育，并在不同孵育时间通过LC-MS进行分析。计算在t = 0小时、t = 24小时和t = 48小时记录的XIC对应的峰面积，以评估由SB-CD和SB在裂解物环境中的降解引起的标准浓度变化。为了克服在不同孵育时间获取的质谱图的m/z信号强度重现性差的问题，考虑了两种峰面积（SB/SB-CD）的比率。

计算出的SB和SB-CD对应峰面积之比（SB/SB-CD）随着孵育时间的推移而增加，这可归因于连接SB与环糊精的酰胺键仅部分水解以及随之形成的SB。然而，SB-CD对蛋白水解酶非常稳定，在48小时后仍存在于培养基中。

3 结论

本研究合成并表征了舒昔布宗（一种属于吡唑啉酮家族的药物）的新型环糊精偶联物（SB-CD）。生物学测定证明，新型偶联物显著增强人20S蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样和胰蛋白酶样活性，其EC₅₀值（Ch-L活性: 0.6 ± 0.1 μM, T-L活性: 1.1 ± 0.3 μM）明显低于舒昔布宗单独使用，表明与环糊精的共价偶联改善了舒昔布宗的生物活性。该偶联物能穿过细胞膜并在胞质中稳定存在许多小时。偶联物在调节蛋白酶体活性方面的高效性可能源于其与蛋白酶体的相互作用，表明该化合物可能类似于其他已研究的吡唑啉酮，结合到RP结合表面的alpha3-alpha4沟槽。对分化SH-SY5Y细胞裂解物的研究证实，SB-CD以剂量依赖方式显著刺激蛋白酶体活性，表明其在细胞环境内调节蛋白酶体功能的潜在功效。SB-CD处理通过增强20S蛋白酶体的活性或效率，加速了细胞的蛋白质降解过程，如在dSHSY5Y细胞培养中所观察到的。此外，舒昔布宗-环糊精偶联物在分化的SH-SY5Y细胞中无毒性，加强了其作为蛋白酶体调节剂在生物系统中应用的潜力。

4 实验部分

βCD3NH₂购自TCI Chemicals；N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）、1-羟基苯并三唑（HOBt）、乙醇胺（ETA）和三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）购自Fluka；SB购自Santa Cruz Biotechnology。分离纯化的人蛋白酶体（h20S）购自Boston Biochem。

核磁共振谱图使用Varian UNITY PLUS-500谱仪在25°C记录。液相色谱-质谱分析使用UltiMate 3000 Proteomics LC仪器，配备Q-Exactive Orbitrap质谱仪。

SB-CD的合成：将βCD3NH₂加入经HOBt和EDC活化的SB的DMF溶液中，在25°C搅拌24小时。蒸发溶剂后，固体通过Rp18柱的快速色谱法纯化，使用水-甲醇线性梯度洗脱。

SB-ETA的合成：将ETA加入经HOBt和EDC活化的SB的DMF溶液中，在25°C搅拌24小时。蒸发溶剂后，固体通过硅胶柱的快速色谱法纯化，使用AcOEt/CH₃OH线性梯度洗脱。

纯化人20S蛋白酶体蛋白水解活性的测定：使用微孔板荧光测定法。将测试化合物在50 mM Tris-HCl（pH 8）中于37°C预孵育15分钟；然后加入终浓度为1.5 nM的h20S蛋白酶体，并在37°C孵育1小时。随后加入针对ChT-L、T-L和C-L肽酶活性的特异性荧光肽底物，通过测量440 nm处的荧光来监测AMC的释放。

细胞毒性试验：在分化的神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y上测试SB-CD活性。细胞用不同浓度的SB-CD处理48小时后，通过MTT法评估细胞活力。

细胞裂解物的制备：通过冻融循环制备未处理的分化细胞的全细胞裂解物。裂解物离心后，上清液用50 mM Tris-HCl（pH 7.4）处理。使用BCA蛋白测定试剂盒定量蛋白质。

细胞裂解物中蛋白酶体活性的测定：使用相同的荧光底物。将等量细胞裂解物与不同浓度的SB-CD和SB在Tris-HCl中孵育后，加入底物并监测1小时。

泛素化蛋白的蛋白质印迹分析：将全细胞裂解物的蛋白质上样到预制胶上，电转移至硝酸纤维素膜。与一抗孵育后，使用荧光标记的二抗，通过成像系统检测杂交信号。

统计分析：所有数据表示为至少三次独立实验的平均值±标准误。使用GraphPad Prism统计软件进行分析。应用单因素方差分析（ANOVA） followed by Tukey's检验。p < 0.05被认为具有统计学显著性。