粘性末端型双价DNA适体M08s-1的设计与评价：一种新型抗凝药物的开发策略

《ChemMedChem》：Design and Evaluation of Sticky End-Type Bivalent DNA Aptamers Containing M08s-1 as Anticoagulant Agents

本文报道了一种基于粘性末端策略的创新型双价DNA适体（Sticky end-type bivalent aptamer）设计，通过将长链适体Pse08-29（106 mer）分割为两条短链（<65 mer），在保持高效抗凝活性的同时显著提升了血清稳定性。研究系统评估了切割位点与连接子长度对适体结构稳定性（G-四链体构象）及功能（aPTT凝血试验）的影响，成功筛选出活性优于已上市药物阿加曲班（argatroban）的候选分子Stick08-29(19-B)，为核酸药物开发提供了合成效率更高、成本更优的新策略。

　　

1 引言

核酸药物作为继小分子和抗体药物后的第三大治疗模态，在靶向性和化学可调性方面展现出独特优势。适体（aptamer）作为单链核酸分子，能够通过折叠形成特定三维结构，实现与靶标的高亲和力结合，其低免疫原性、化学合成成本低等特性使其在抗凝治疗领域备受关注。凝血酶（thrombin）作为凝血级联反应的核心丝氨酸蛋白酶，通过其两个底物识别区域（exosite I和II）调控纤维蛋白原转化和凝血因子激活，成为适体药物的理想靶点。

研究团队前期通过SELEX技术筛选出靶向exosite I的DNA适体M08s-1，其抗凝活性优于曾进入临床试验的适体NU172。进一步通过刚性双链DNA连接子将M08s-1与靶向exosite II的适体TBA29连接，构建了异源双价适体Pse08-29，其在体外（ex vivo）抗凝活性显著超越临床常用药物阿加曲班（argatroban），且可通过互补链杂交实现活性调控，潜在降低出血风险。然而，Pse08-29的长链结构（106 mer）导致化学合成效率低（理论产率约60%）、易出现碱基缺失或错误折叠等问题，限制其药物化开发。

为解决长链适体的技术瓶颈，本研究提出“粘性末端型”（sticky end-type）适体设计策略：将Pse08-29分割为两条带有单链突出末端（sticky end）的片段，通过互补杂交自组装为功能单元。该策略借鉴DNA折纸（DNA origami）技术中粘性末端的高效组装特性，旨在实现适体链长缩短、合成效率提升的同时，维持其结构完整性与生物活性。

2 结果与讨论

2.1 切割位点对G-四链体结构稳定性的影响

通过圆二色谱（CD）分析M08s-1和TBA29的G-四链体（G-quadruplex, G4）构象发现，截断位点临近G4核心区域时（如M08s-1截断至第3、4位核苷酸），其构象由杂交型（hybrid-type）转为平行型（parallel-type），可能导致功能丧失。最终确定M08s-1的切割阈值位于第2位核苷酸，TBA29为第3位，超出此范围将破坏靶标结合必需的空间结构。

2.2 粘性末端适体的抗凝活性筛选

设计5组切割位点（A–E）及不同长度连接子（13–20 mer）的适体库，通过活化部分凝血活酶时间（aPTT）试验评估其在人/小鼠血浆中的抗凝活性。结果显示，切割位点B、C、D（位于连接子区域内）的适体活性显著优于Pse08-29，而位点A（侵入功能域）和E（互补区过短）活性较差。其中Stick08-29(13-E)、Stick08-29(19-B)等8种适体在两种血浆中均表现出更强活性（p?

2.3 复合物稳定性与血清耐受性

非变性PAGE（Native PAGE）和NUPACK软件模拟表明，连接子长度≥17 mer的适体更易形成稳定复合物。值得注意的是，部分未完全杂交的适体（如Stick08-29(13-E)）仍具高活性，提示其可能通过凝血酶exosite I/II间的变构效应（allosteric effect）协同作用。进一步血清稳定性实验显示，Stick08-29(19-B)在50%人/小鼠血清中孵育4小时后未出现降解，半衰期约4小时，显著优于Pse08-29（约30分钟）。其稳定性提升可能源于G4结构对切口位点（nick site）的立体保护作用，而Stick08-29(20-C)的快速降解表明序列微环境对核酸酶抗性具有关键影响。

3 结论

本研究成功构建了粘性末端型双价DNA适体Stick08-29(19-B)，其通过优化切割位点与连接子长度，在保留高效抗凝活性（优于Pse08-29、NU172及阿加曲班）的同时，实现了血清稳定性提升和合成成本降低（链长<65 mer）。该策略为长链核酸药物的工程化改造提供了新思路，未来可进一步探索其互补链中和机制以控制出血风险。

4 实验方法

适体由Eurofins Genomics合成，经95°C退火后用于后续实验。CD光谱使用JASCO J-1500光谱仪在220–320 nm波长范围检测；aPTT试验通过全自动凝血仪监测凝血时间；复合物稳定性采用12%非变性PAGE评估；血清稳定性实验通过尿素变性PAGE（Urea PAGE）分析降解程度。