血管渗漏减少与乳腺癌调节性T细胞浸润相关但与转移倾向无关

《Molecular Oncology》：Reduced vascular leakage correlates with breast carcinoma T regulatory cell infiltration but not with metastatic propensity

本文探讨了血管内皮细胞中Shb基因缺失通过降低血管渗漏（血管正常化）并改变免疫细胞（IC）基因表达，导致乳腺癌免疫抑制微环境形成。研究发现低渗漏表型与调节性T细胞（Treg）浸润增加相关，但未直接促进转移，为靶向血管-免疫互作（如VEGFA、PD-L1/PD-1、CTLA4）的乳腺癌治疗提供新视角。

　　

引言

癌症是一种使人衰弱的疾病，肿瘤转移是最常见的死亡原因。肿瘤扩张和转移是复杂的过程，涉及肿瘤细胞与基质之间的相互作用。肿瘤细胞通常通过诱导抗原呈递细胞减少抗原呈递、抑制CD4⁺ T辅助细胞或抑制CD8⁺ T杀伤细胞来逃避适应性免疫系统的识别和靶向。此外，先天免疫可能通过招募髓源性抑制细胞（MDSC）或肿瘤相关巨噬细胞（TAM）以促肿瘤方式被驯化。肿瘤血管系统通常功能失调和渗漏，这些特征在肿瘤细胞内渗、血行传播和转移中起作用。血管系统也是免疫细胞外渗浸润肿瘤的门户，因此可以预期血管系统在调节肿瘤免疫反应中发挥作用。

材料与方法

小鼠实验

动物实验经乌普萨拉县法院动物伦理委员会批准。雌性小鼠用于实验。E0771.lmb肿瘤在野生型和Shb iECKO（内皮细胞条件性缺失Shb）小鼠中生长。小鼠在肿瘤细胞注射后第14-16天处死，肿瘤被消化，通过MACS?微珠分离CD45⁺细胞，随后通过荧光激活细胞分选（FACS）分离CD31⁺细胞。

RNA测序

测序文库使用Chromium Next GEM Single Cell 3′试剂盒制备。原始序列数据使用Cell Ranger软件处理，读取与小鼠基因组mm10对齐。原始基因计数数据加载到R Seurat包中进行质量控制和下游分析及可视化。细胞过滤后，使用尺度因子10,000对原始基因表达计数进行标准化。使用CCA方法校正批次效应，整合所有样本。使用vst方法获得前2000个可变基因，前30个主成分用于共享最近邻聚类分析和均匀流形近似与投影（UMAP）可视化。

人类乳腺癌队列

使用2014年至2022年在乌普萨拉大学医院诊断的三阴性乳腺癌（TNBC）患者队列研究20个肿瘤中IC和血管标志物的表达。研究根据《赫尔辛基宣言》进行，经瑞典伦理审查机构批准。选择TNBC是因为其复杂的转移和免疫逃避机制，是研究血管渗漏和免疫细胞浸润在肿瘤进展中作用的理想模型。选择10例有转移复发和10例无复发的病例，以促进更平衡的肿瘤行为比较。

多重免疫荧光

多重染色使用BOND RX自动染色机进行。石蜡包埋切片（4μm）脱蜡，首先使用表位检索溶液2进行抗原检索。染色开始后，分别按照面板1和2的抗体顺序进行六个后续染色循环：VE-cadherin、PD-L1、纤维蛋白肽A（FpA）、CD4、FoxP3、CTLA4和PD-L1、PD-1、颗粒酶B、CD163、CD20、CD8。每个染色循环后，用无血清蛋白阻断剂封闭5分钟。加入一抗孵育30分钟，然后与二抗孵育10分钟。最后与酪胺信号放大孵育10分钟，使用opal染料。所有切片用DAPI复染核5分钟，然后使用ProLong Diamond Antifade media封片。

统计学

使用Prism 10进行组间数据统计比较，使用Student's t-检验（配对或未配对，视情况而定）或相关分析。对scRNAseq数据进行多重比较校正，但选定的基因表达（15个基因）未校正。批量RNAseq和相关分析未进行多重比较校正。未校正数据用于优先排序基因表达模式变化或可能的相关模式。

结果

免疫细胞单细胞RNA测序（scRNAseq）

为评估Shb iECKO E0771.lmb实验性乳腺癌模型中免疫抑制表型的细节，对CD45⁺细胞进行了scRNAseq。Seurat聚类识别出30个独立簇。簇0-6、8、10、13、15、17和18主要由巨噬细胞/单核细胞群体组成，簇7、12、19和26由T细胞组成，簇9、11、25由树突状细胞（DC）组成，簇21由浆细胞样树突状细胞（pDC）组成，簇24由中性粒细胞组成，簇27由B细胞组成，簇29由自然杀伤（NK）细胞组成。簇14、16、20和23主要表达成纤维细胞标志物，簇22表达内皮标志物，簇28表达壁细胞标志物，簇30表达上皮标志物，因此这些簇未进一步分析，而巨噬细胞/单核细胞、T细胞和DC簇进行了更详细的分析。

巨噬细胞/单核细胞簇的表征显示，簇4显示IFN谱，且是免疫检查点蛋白PD-L1基因（Cd274）表达最高的簇。该簇的细胞数量因敲除基因型而增加。其他显示脂质或IFN谱的簇包括3、6、13、15、17和18。

在所有四个T细胞簇（7、12、19和26）中表达Cd4，而Cd8a在簇26中相对稀疏表达。簇19和26通过表达Foxp3包含Tregs。野生型群体中Foxp3⁺/Cd4⁺双阳性细胞占CD4⁺细胞的百分比为16±6，而在Shb iECKO群体中为22±7（配对Student's t-检验P<0.05），表明内皮Shb缺陷导致免疫抑制条件。

DC簇表征显示，簇25主要包含cDC1细胞，这些是抗原呈递细胞。该簇的细胞数量在Shb iECKO小鼠中显著减少，支持在这些条件下免疫激活减少的观点。簇9主要由cDC2细胞组成，簇11由mregDC细胞组成。簇21由pDC细胞组成。

内皮细胞Shb缺陷导致的差异表达免疫细胞基因（DEGs）

DEGs通过每个簇中单个细胞的基因表达确定。选定的显著基因表达变化总结显示，一组描述为IFN诱导的基因在大多数簇中可检测为DEGs，尽管细胞群体中IFN表达没有增加。这些基因根据GenBank描述调节病毒进入、DNA结合、凋亡、线粒体定位和泛素连接酶。它们在免疫细胞中对肿瘤生物学的后果尚不清楚，尽管在终末耗竭T细胞中观察到高水平的Ifitm2。核糖体蛋白编码基因的表达增加常见，表明Shb iECKO小鼠肿瘤IC中蛋白质合成增加。

一组趋化因子（Ccl2、Ccl4、Ccl5、Ccl7、Ccl8、Ccl12、Ccl22、Ccl24和Cxcl10）在DEGs中显著检测到。这些以大部分重叠的方式与趋化因子受体Ccr1、Ccr2、Ccr3、Ccr4、Ccr5和Cxcr3相互作用。趋化因子通过招募各种免疫细胞改变免疫反应，其效果因情境而异。因此，这些变化对免疫反应的净效果难以预测。评估基于个体趋化因子表达的趋化因子受体刺激，Ccr1似乎接收刺激和抑制信号，Ccr2抑制信号，Ccr3刺激和抑制信号，Ccr4抑制信号，Ccr5刺激和抑制信号。在提供混合信号的情况下，不同细胞类型之间的空间关系可能很重要。

Klf2、Kl4（转录因子）和Gdf15（细胞因子）已被证明抵抗炎症条件，而Jund编码转录因子，是炎症细胞因子如Il1b产生所必需的。这些基因的表达减少因此也表明Shb iECKO肿瘤中的炎症状态减少。

Vcam1编码细胞粘附分子，与整合素Itga4相互作用，内皮Vcam1参与白细胞招募。巨噬细胞Vcam1可能涉及IC/IC相互作用，表达Vcam1的巨噬细胞通常存在于肿瘤中。此外，表达Vcam1的巨噬细胞也表达免疫刺激产物Trem2。因此，减少的Vcam1表达与Shb iECKO巨噬细胞中Trem2表达减少并行。

T细胞和DC簇中未在巨噬细胞/单核细胞簇中观察到的基因表达变化也已列出。Il2ra（CD25）特别相关，因为表达升高（簇19中37%）与更多Tregs兼容。Ccl22属于DC特异性变化，如上所述。

基于每个样本和簇的平均基因表达，然后配对比较相应的野生型和Shb iECKO群体，还计算了15个对免疫抑制重要的选定基因的基因表达差异。根据这些比较，11个在相关巨噬细胞或T细胞簇中显著（个体P值<0.05）不同。在巨噬细胞/单核细胞中，免疫刺激基因产物Ifng（所有巨噬细胞/单核细胞簇结合减少50±13%）和Trem2（结合簇0-6减少18±7%）表现出显著减少的表达，而免疫抑制基因Visr/VISTA（结合簇0和4增加7±2%）和Cd276（结合簇0和4增加11±2%）显著增加。在T细胞中，Treg标志物Foxp3（结合簇19和26增加36±16%）或免疫抑制/免疫检查点基因Icos（结合簇12、19、26增加11±5%）、Ctla4（结合簇7、12、19、26增加22±11%）、Tigit（结合簇7、12、19增加153±71%）和Havcr2/TIM3（簇7增加35±13%）在Shb iECKO肿瘤的IC中均表现出小幅但显著增加的表达。Ctla4、Tigit和Havcr2/TIM3在耗竭T细胞中高表达。Cd200（结合簇7、12和26减少23±11%），活性T效应细胞的标志物，和Cd80（结合簇12和26减少14±4%）在相同条件下减少。Lag3、Cd274（PD-L1）、Pdcd1lg2（PD-L2）或Pdcd1（PD1）的表达水平未改变。尽管PD-L1和PD1是重要的免疫检查点蛋白，但它们缺乏改变的表达不一定使其他免疫检查点基因表达变化的相关性无效，因为最终的免疫抑制状态将是许多微小变化的产物，最终将使反应倾向于促肿瘤状态。

总之，响应Shb iECKO的IC基因表达谱，尽管变化适中，但表明整体免疫抑制模式，这可能是髓系细胞中观察到的改变趋化因子和细胞因子谱的结果。这一观点通过IFN-巨噬细胞簇4细胞数量的增加而得到进一步强化，该簇对应于肿瘤中常见的Cd274（PD-L1）高巨噬细胞簇，因此可能支持肿瘤，以及抗原呈递cDC1簇25细胞数量的减少。

内皮细胞Shb缺陷导致的免疫细胞DEGs的基因本体（GO）分析

通过Toppgene进行的GO分子功能涉及“核糖体结构成分”（P<0.0001）、“CCR1、CCR2、CCR4和CCR5趋化因子受体结合”和“细胞因子受体结合”（P<0.02）、“细胞粘附分子结合”（P<0.02）和“脂蛋白颗粒结合”（P<0.02）在巨噬细胞/单核细胞中观察到。簇18中观察到“硫氧还蛋白过氧化物酶活性”（P<0.01）。这些对生物过程“对病毒和生物刺激的反应”、“对脂质的反应”、“免疫反应调节”和“淋巴细胞或T细胞激活”产生了显著变化。作为细胞成分，“核糖体”和“粘着斑”被识别。在T细胞中，观察到“趋化因子受体结合”（P<0.0001）、“抗原结合”（P<0.05）、“胶原结合”（P<0.05）和“免疫受体活性”（P<0.05）。这些对“免疫系统过程调节”、“对生物或病毒刺激的反应”和“T细胞激活”有影响。细胞成分“内溶酶体”（P<0.02）和“细胞外基质”（P<0.05）发生变化。DCs（簇25）表现出“核糖体结构成分”（P<0.05）和“对细胞因子的反应”（P<0.05）。变化的生物过程是“对病毒或生物刺激的反应”和“免疫系统过程调节”。

Shb缺陷肿瘤中的内皮细胞基因表达变化

在四个独立实验中，对来自九个野生型和八个KO肿瘤的野生型和Shb iECKO样本进行了批量EC RNAseq。计算每个单独实验中每个基因型的平均值，并通过配对Student's t-检验进行比较。基因表达的显著差异和所有基因的表达值显示。差异表达基因的基因本体（GO）分析显示。记录的GO相当非特异性，包括许多过程和成分，如细胞骨架、粘着斑、核糖体、内皮屏障和凋亡。使用文献中编译的大量配体/受体相互作用，我们然后分析了在配体/受体背景下的显著EC基因表达变化。EC配体变化及其EC受体伙伴显示。EC配体分为“分泌配体、细胞表面配体（包括配体信号传导的细胞内修饰）和细胞外基质”。最后，所有显著的EC受体变化显示。

为了理解图3A、B和表中差异表达的EC配体和EC受体相互作用的可能相关性，检索了文献中报告的响应，并提出了与血管系统及其对免疫细胞影响最可能和突出的效应。支持减少出芽血管生成和渗漏的基因表达变化根据文献强烈主导，与实验观察一致。这些包括Notch4、Dll4、Jag1、Src、Prprj、Sdc1、Sdc2、Sdc4、Vegfa、Fgd5、Ptk2b、Efnb1、Sema3a、Sema4b和Sema6d。只有Plcg1的增加作为表明相反效应的变化突出。

有许多EC DEGs编码可能感兴趣的受体。Erbb3已被证明对体外内皮细胞骨架重要。此外，Ednra编码内皮素受体，Gpr135编码缓激肽受体，Npr1编码利钠肽受体，Ptprs编码定位于连接的受体酪氨酸磷酸酶，Rpsa编码层粘连蛋白受体，Traf3编码与T细胞上Cd40lg相互作用的产品。这些在当前情境中尚未详细探索，但可能是免疫反应中相关的介质。

总之，EC基因表达变化可能对免疫系统发挥多效性效应。可能部分解释Shb-KO肿瘤抗炎状态的一种改变是Sema3a依赖性招募表达Tgfb1的单核细胞。

血管屏障形态和肿瘤缺氧作为EC Shb缺陷的结果

对乳腺癌Shb iECKO模型中免疫细胞基因表达谱感兴趣的是血管系统在渗漏和氧合方面的功能。我们先前报道该模型中渗漏减少。这通过Shb iECKO导致肿瘤血管系统更广泛的VE-cadherin覆盖得到证实，与减少的渗漏一致，并进一步表明免疫表型不是血管渗漏增加的直接后果。此外，通过Hif1a染色评估，没有缺氧增加的迹象，反驳了免疫细胞改变是缺氧诱导的假设，并进一步支持血管正常化的概念。

人类乳腺癌的血管和免疫细胞特征

为了将实验小鼠数据中增加的转移和减少的渗漏与免疫抑制环境并行与人类乳腺癌联系起来，对20个三阴性乳腺癌的队列进行了血管和免疫细胞标志物的染色。肿瘤特征已总结。切片染色用于VE-cadherin（内皮粘附连接）、FpA（纤维蛋白原肽A反映渗漏）、CD4（T辅助细胞）、FOXP3（Tregs）、CTLA4（表达CTLA4免疫检查点蛋白的免疫抑制T细胞）、CD8（T杀伤细胞）、PD1（响应PD-L1的免疫抑制T细胞）、PD-L1（CD274，免疫检查点蛋白）、CD163（CD163，巨噬细胞标志物）、CD20（MS4A1，B细胞标志物）和颗粒酶B（GZMB，T和NK细胞活性靶细胞杀伤标志物）。围绕肿瘤本身的基质通常富含免疫细胞，并显示更高的血管密度。

不同肿瘤中免疫细胞群体中，FOXP3染色的核几乎 exclusively在CD4⁺细胞中，肿瘤FOXP3⁺细胞计数与CD4⁺细胞计数相关，确实支持这些主要是CD4⁺ Tregs的观点。因此，FOXP3⁺/CD4⁺比率被视为T辅助细胞中Tregs的相对比例。CTLA4⁺与CD4⁺细胞和FOXP3⁺/CD4⁺细胞相关，表明Tregs通常表达免疫检查点蛋白CTLA4。然而，CTLA4染色偶尔在非免疫细胞中观察到，这在一个肿瘤中特别明显（患者六的肿瘤），表明该队列中一些肿瘤细胞也表达CTLA4。CD4⁺细胞也与CD8⁺、CD20⁺和CD163⁺细胞正相关，符合整体发炎肿瘤表型。颗粒酶B确定为GZMB⁺/CD8⁺细胞的比率，该比率与肿瘤中任何其他血管或IC标志物不相关。PD1，耗竭CD8⁺细胞的标志物，也未显示与任何其他血管或IC标志物相关。GZMB⁺/CD8⁺或PD1⁺/CD8⁺细胞的百分比低（在任何肿瘤中从未超过21%），只有颗粒酶B与CD8显示相关共表达，表明肿瘤没有显示主动细胞毒性或CD8⁺耗竭的倾向。

当比较这些肿瘤中血管密度（VE-cadherin染色）与免疫细胞群体时，观察到CD4、FOXP3和CTLA4的正相关。这表明高血管密度确实促进免疫细胞浸润。然而，渗漏与血管密度和CD4⁺、FOXP3⁺、CTLA4⁺和PD-L1⁺细胞的肿瘤浸润不相关。唯一显示与渗漏相关（负相关）的T细胞群体是FOXP3⁺/CD4⁺细胞，即相对Treg丰度，在高渗漏肿瘤中显著减少。相对Treg丰度可能是免疫抑制的重要因素，因为不仅总细胞群体数量重要，而且特定细胞群体的相对比例也重要。肿瘤大小和CD163（巨噬细胞标志物）也显示与渗漏负相关，表明渗漏与肿瘤生长-巨噬细胞-Tregs之间可能存在负关系。免疫检查点蛋白PD-L1主要在CD163⁺细胞中表达，并与CD4⁺和CD163⁺表达相关。

与此相反，肿瘤转移在表现出较少渗漏的患者中似乎较少见。而10名高渗漏患者中有7名出现转移，低渗漏患者的转移在10名患者中有3名观察到。然而，这种差异无统计学意义（卡方检验P=0.074），可能由于患者数量少。然而，低渗漏患者的生存期增加。“高”与“低”渗漏组之间年龄无显著差异（分别为65.8±4.3和68.4±4.6岁，P=0.69）。

这些发现部分证实了实验小鼠模型中EC中Shb基因失活导致肿瘤渗漏减少和免疫抑制增加的结果。然而，血管渗漏在人类乳腺癌转移中似乎比免疫抑制起主要作用。

讨论

本研究旨在通过研究低血管渗漏条件下的IC和EC基因表达变化，理解EC在调节乳腺癌免疫反应中的作用。这是由在EC中条件性Shb缺陷的实验小鼠模型中，原位E0771.lmb三阴性乳腺癌转移由于免疫抑制而非血管渗漏增加而增加的观察所驱动的。本研究对人类乳腺癌的主要发现是免疫抑制与减少的血管渗漏相关，而转移可能在渗漏高的肿瘤中更普遍。实验小鼠模型表明这是原发性内皮效应，因为Shb缺陷在内皮细胞中诱导。这可能推断人类数据中免疫抑制和渗漏也反映了原发性内皮改变。

对因Shb缺陷发生的EC基因表达变化的深入分析主要支持非渗漏血管系统，血管VE-cadherin覆盖比例增加也是如此。这种血管表型，连同未改变的肿瘤氧合，符合“血管正常化”的概念。最近的一项研究报道，通过血管生成抑制的血管正常化选择性增加CD8⁺ T细胞浸润到肝细胞癌中。该发现与本研究目前减少血管渗漏支持特定免疫细胞群体选择性外渗的发现一致。然而，与本研究目前发现相反，该研究中选择性刺激了IC组分（CD8⁺效应细胞），促进了免疫反应。这种二分法表明，对“血管正常化”的特定IC反应受局部肿瘤环境控制，包括氧合程度和/或细胞因子/趋化因子产生，因此反应不能轻易分类为 simply “免疫抑制”或“免疫刺激”，而是这些的混合，其中平衡可能由于微小的局部差异而偏向任一方向。尽管血管正常化在许多癌症模型中被发现提高免疫治疗的疗效，但我们不认为本研究目前的数据必然与此概念矛盾。具有Tregs丰度增加的免疫抑制环境，如当前观察到的，可能更易于免疫检查点抑制，因为这种细胞类型响应抗PD-L1免疫治疗。

不确定选择性免疫反应是否仅是减少血管渗漏的结果，还是反映了平行的内皮过程。在非渗漏Shb iECKO肿瘤中观察到许多EC基因表达变化，这些预期对IC功能发挥多效性效应。这为不同肿瘤中 disparate 免疫反应提供了理由——取决于局部条件，不同的反应将主导。

实验模型中的IC景观表明 primarily 免疫抑制环境，具有相对更多的Tregs，略微增加的免疫检查点蛋白表达，和更少的cDC1抗原呈递细胞。这是EC表型的直接后果还是继发于EC依赖的单核细胞/巨噬细胞群体变化目前无法确定。在单核细胞/巨噬细胞群体中，观察到大量变化，一些免疫抑制，其他免疫刺激，难以预测负责免疫抑制的变化。

当研究人类三阴性乳腺癌队列时，注意到不同肿瘤在血管和IC特征方面的相当大的变异。显着地，三个高渗漏肿瘤显示免疫抑制细胞低浸润，而三个低渗漏肿瘤具有免疫抑制细胞高浸润。因此，认为确定队列内不同参数之间的相关性是建立相关差异的适当方式。因此，观察到渗漏与Tregs或CD163巨噬细胞之间的负相关。两者类似改变符合Tregs和髓系细胞之间的相互依赖。然而，人类乳腺癌中Tregs的存在似乎对转移的作用次于渗漏，因为渗漏较少的肿瘤未表现出太多转移，而是更长的生存期。这与小鼠实验模型相反。尽管实验小鼠模型在提出与人类疾病相关的机制方面有用，但它们对全面理解的适用性有限。与转移不同，肿瘤大小在人类疾病中低渗漏肿瘤增加。这表明肿瘤生长和肿瘤转移是两个独立的过程。

应注意肿瘤样本量有限（20名患者），因此未来需要在更大的独立肿瘤队列中验证。

结论

总之，EC表型影响免疫反应，在乳腺癌的情况下， primarily 在低血管渗漏肿瘤中免疫抑制。一个可能的解释是选择性IC外渗，改变肿瘤IC景观，从而 confer 许多基因表达变化，包括趋化因子的变化。因此，在低血管渗漏肿瘤中Tregs选择性增加。从一般 perspective，数据符合选择性IC外渗依赖于完整功能连接的概念，免疫抑制或免疫刺激条件是局部环境的结果。这表明人类肿瘤中的血管系统在塑造免疫动态中起关键作用，因此是治疗干预的重要靶点。靶向血管功能可以增强抗肿瘤免疫反应或限制转移扩散，取决于肿瘤微环境的特定特征。