基于分裂纳米荧光素酶的即用型生物发光免疫传感器用于非洲猪瘟病毒抗体的一步法灵敏检测

《Microbial Biotechnology》：Development of a Ready-To-Use Bioluminescence Immunosensor for the One-Step Sensitive Detection of Antibodies Against African Swine Fever Virus

本研究报告了一种基于分裂纳米荧光素酶（NanoLuc）的即用型均相免疫传感器，可实现非洲猪瘟病毒（ASFV）抗体的快速（10分钟）、一步法检测。该技术通过将NanoLuc亚基SmBiT/LgBiT分别与ASFV p30蛋白和蛋白G的C2结构域融合，在抗体存在时重构功能性荧光素酶并产生高强度生物发光信号。与ELISA相比具有更高灵敏度（提高8倍）和98.71%的临床符合率，为现场检测（POCT）提供了创新解决方案。

　　

传感器设计

研究团队创新性地利用分裂荧光素酶互补技术构建了新型免疫传感器。其核心设计是将纳米荧光素酶（NanoLuc）的大亚基LgBiT与蛋白G的C2结构域融合（LgBiT/C2），小亚基SmBiT与ASFV p30抗原融合（SmBiT/p30）。当样本中存在ASFV特异性IgG抗体时，两个探针会同步结合到同一抗体分子的Fc和Fab区域，形成三元免疫复合物。这种空间上的接近促使LgBiT和SmBiT亚基重构为有活性的NanoLuc酶，在底物呋喃嗪存在下产生强烈的生物发光信号。整个检测过程只需将血清样本与两种融合探针混合孵育一步操作，无需洗涤步骤即可直接测量发光值。

融合传感器的表达与验证

研究人员通过分子克隆技术构建了四种融合探针：LN-C2（LgBiT-N端融合）、LC-C2（LgBiT-C端融合）、SN-p30（SmBiT-N端融合）和SC-p30（SmBiT-C端融合）。这些蛋白在^E. ^coli表达系统中成功表达，并通过镍柱纯化获得高纯度产物。SDS-PAGE和Western blot验证显示所有融合蛋白均正确表达。特别值得注意的是，Western blot分析证实SN-p30和SC-p30融合探针均能保持与ASFV抗体的特异性结合能力，表明SmBiT的融合并未影响p30抗原的免疫反应性。

融合传感器的筛选

为确定最优传感器组合，研究团队系统比较了四种传感器配对（LN-C2+SN-p30、LN-C2+SC-p30、LC-C2+SN-p30、LC-C2+SC-p30）的性能。所有组合均能区分ASFV阳性与阴性血清，但LN-C2与SN-p30的组合表现出最高的信噪比（S/N），因此被选为后续实验的最优配对。这一结果突显了NanoLuc亚基在结合元件N端融合时最有利于功能性荧光素酶的重构。

分裂纳米荧光素酶互补检测法的建立

通过棋盘滴定法优化实验条件发现，50 ng LN-C2和6.25 ng SN-p30的配比能产生最大发光信号和最低背景噪声。血清用量优化显示1 μL（1:100稀释）血清可获得最佳S/N值，过高浓度会出现"钩状效应"。反应时间优化表明10分钟孵育即可达到理想检测效果，满足快速检测需求。基于191份阴性血清样本建立了 cutoff值为3.7113（均值+3SD），为临床样本判定提供了可靠标准。

交叉反应与分析灵敏度

特异性评估显示，该传感器对经典猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、伪狂犬病毒（PRV）等常见猪病原体阳性血清均无交叉反应，证明其高度特异性。灵敏度比较实验表明，该方法的检测限达到1:2048稀释度，比商业化ELISA试剂盒（1:256）灵敏度提高8倍，这得益于NanoLuc系统极高的亮度与极低的背景信号。

样本分析与验证

在309份临床猪血清样本的盲法测试中，该传感器与商业化INGENASA ELISA试剂盒的符合率达到98.71%（133例阳性、172例阴性一致），Kappa值为0.9737，表现出优异的临床适用性。四例 discrepant样本可能源于检测灵敏度差异或血清中抗体水平的动态变化。

结论

本研究成功开发了一种基于分裂NanoLuc技术的即用型生物发光免疫传感器，实现了ASFV抗体的快速、高灵敏、高特异性检测。该方法操作简便（一步法10分钟完成）、无需复杂设备，特别适用于现场快速诊断。通过替换特异性探针，该平台可轻松适配其他病原体抗体检测，展现出良好的通用性前景。