金属球状菌AbfR1同源蛋白作为类核组织蛋白的功能表征及其在古菌染色质结构中的作用

《MicrobiologyOpen》：The Lrs14-Like AbfR1 Homolog From Metallosphaera sedula Is a Nucleoid-Organizing Protein

本研究深入探讨了Metallosphaera sedula中Lrs14家族蛋白AbfR1Ms的非序列特异性DNA结合特性，通过ChIP-seq（染色质免疫沉淀测序）和AFM（原子力显微镜）等技术揭示其全基因组结合模式及DNA凝聚功能，表明其类似细菌NAP（类核相关蛋白）的结构角色，为古菌染色质组织机制提供了新见解。

　　

引言

古菌Crenarchaeota门缺乏组蛋白，依赖多种小DNA结合蛋白进行染色质组织，这些蛋白功能类似于细菌的类核相关蛋白（NAP）。Lrs14家族是硫化叶菌目（Sulfolobales）中广泛存在的一类小DNA结合蛋白，但其功能尚不明确。先前研究表明，Lrs14型蛋白AbfR1在^{Sulfolobus acidocaldarius}中参与生物膜形成和运动性的调控。本研究旨在探究^{Metallosphaera sedula}中AbfR1同源蛋白（AbfR1_Ms）的DNA结合特性，评估其序列特异性、全基因组结合位置以及对DNA的结构影响。

材料与方法

通过生物信息学分析、结构建模、异源蛋白表达与纯化、Western blot分析、电泳迁移率变动分析（EMSA）、染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和原子力显微镜（AFM）等技术，全面表征AbfR1_Ms的DNA结合特性。

结果

3.1 ^{M. sedula}中保守的AbfR1同源蛋白

AbfR1_Ms与^{S. acidocaldarius}中的AbfR1_Sa具有50%的氨基酸序列一致性和80.17%的相似性。多重序列比对显示，DNA结合关键残基（如Y86、R55和K61）在AbfR1同源蛋白中高度保守。

3.2 AbfR1_Ms形成由二硫桥稳定的二聚体

AbfR1_Ms在溶液中形成二聚体，并通过C105残基形成二硫桥稳定二聚体结构。Western blot分析显示，在还原剂存在下，二聚体主要恢复为单体状态。该蛋白表现出良好的热稳定性，在70°C处理下仍保持可溶性。

3.3 AbfR1_Ms以非序列特异性方式与DNA结合

EMSA分析表明，AbfR1_Ms以非序列特异性方式与各种DNA探针结合，形成阶梯状结合模式。结合发生在低蛋白浓度（94nM）下，表明二聚体对DNA具有高亲和力。竞争实验进一步证实了其非序列特异性结合特性。

3.4 AbfR1_Ms在^{M. sedula}基因组中的结合关联

ChIP-seq分析揭示了AbfR1_Ms在全基因组范围内的广泛结合，共鉴定出658个富集区域，其中153个区域显示超过两倍的富集。富集区域倾向于位于基因间区域，这些区域具有较高的AT含量。结合区域长度通常超过1000bp，表明AbfR1_Ms与扩展的DNA区域结合。

3.5 AbfR1_Ms在体外凝聚质粒DNA

AFM成像显示，AbfR1_Ms在低蛋白浓度下即可诱导DNA凝聚，形成明显的凝聚位点。随着蛋白浓度增加，DNA-蛋白复合物形成更大的球状凝聚簇，表明AbfR1_Ms具有促进DNA高级结构形成的功能。

讨论

AbfR1_Ms作为Lrs14家族蛋白，在结构和功能上与其他古菌染色质蛋白相似。其非序列特异性DNA结合能力和DNA凝聚功能表明它在古菌染色质组织中扮演重要角色，类似于细菌的NAP。本研究结果挑战了AbfR1_Ms作为3HP/4HB途径特异性转录调节因子的观点，支持其更广泛的基因组结构功能。

作者贡献

Veerke De Kock负责主要分析、调查、方法学和可视化；Ronnie Willaert和Yannick Gansemans参与调查和方法学；Filip Van Nieuwerburgh提供方法学支持；Rani Baes参与概念化和文章修订；Eveline Peeters领导概念化、资金获取和文章修订。

致谢

感谢研究团队的技术支持和资金援助，本研究由弗拉芒研究基金会（FWO）和布鲁塞尔自由大学战略研究计划资助。

伦理声明

作者声明无利益冲突。

附录

提供了详细的实验数据、图表和表格，包括系统发育树、基因组环境分析、突变体DNA结合分析、结构模型、尺寸排阻色谱结果、EMSA定量分析以及个体ChIP-seq图谱等补充信息。