基于聚(2-噁唑啉)的多重响应聚光酸：新型细胞内转运体的合成、溶液行为与细胞摄取研究

《Macromolecular Rapid Communications》：Poly(2-Oxazoline)-Based Polyphotoacids: Synthesis, Solution Behavior, and Cellular Uptake of Multi-Responsive Intracellular Transporters

本工作首次报道了基于聚(2-噁唑啉)(POx)的聚光酸材料，通过将1-羟基芘(一种在蓝光照射下可通过激发态质子转移(ESPT)增强酸性的光酸)单元引入聚合物侧链，实现了对材料极性和电荷的远程光控。该多重刺激响应聚合物体系展现出优异的生物相容性(细胞存活率>90%)、高效细胞摄取(最快1小时内)和显著疏水药物负载能力(姜黄素负载量达48 mg/g)，为智能药物递送系统开发提供了新策略。

　　

引言

合成聚合物在生物医学领域的应用探索主要集中于功能、结构和靶向分子的调控可能性。作为生物材料，这些聚合物必须满足无毒和生物相容等特定标准。传统上，基于聚乙二醇(PEG)的材料因其隐形特性和生物相容性被广泛应用，但近年研究发现PEG存在不可生物降解、与血液发生非特异性相互作用、可能引起超敏反应等局限性。在此背景下，聚(2-噁唑啉)(POx)作为PEG基生物材料的有前景替代品脱颖而出。POx可通过2-取代-2-噁唑啉单体的活性阳离子开环聚合(CROP)合成，其丰富的化学性质、直接合成方法以及定制摩尔质量、亲疏水平衡和结构的能力使其成为理想生物材料。与PEG相比，POx对抗氧化降解具有更高稳定性，能在活性氧存在下更有效地保持功能和结构。此外，POx可通过侧链功能化赋予对pH、温度、溶液离子强度或酶活性的响应性，从而创建多功能适应性材料。

光响应聚合物在暴露于不同波长光时会发生改变。通过引入偶氮苯、芘和螺吡喃等衍生物功能基团，可开发出在光照下诱导可逆异构化的光响应聚合物系统。尽管单刺激响应聚合物在生物医学应用中取得了许多进展，但此类系统克服生物屏障的能力有限。多刺激响应载药聚合物纳米粒子能够更有效地穿过生物屏障，这最终决定了治疗的有效性。这类材料在生物医学应用中具有重大意义，特别是对于癌症治疗。温度和光是可以外部应用于任何系统的物理刺激，其中光甚至可以时空控制。因此，结合光开关为热响应大分子的构象行为提供了额外调控手段。

材料合成与表征

本研究通过聚(2-乙基-2-噁唑啉)前体的部分水解，然后与6/8-乙酰氧基芘-1-磺酰氯进行功能化，制备了一套多刺激响应聚合物。通过改变试剂比例，可以实现水解单元的完全或部分功能化；在后一种情况下，还可以实现一些剩余的聚乙烯亚胺(PEI)基团。聚(2-乙基-2-噁唑啉)均聚物根据标准协议合成，随后通过酸性水解获得聚(2-乙基-2-噁唑啉)-共-聚(乙烯亚胺)(PEtOx-共-PEI)。水解时间设定为50、100、200和300分钟，从NMR可以看出PEI单元分数的逐步增加。最后步骤是在碱存在下用AcOPyrSO₂Cl对PEtOx-共-PEI进行磺化。目标聚光酸的成功合成通过NMR中2.75 ppm处PEI信号的消失和芳香峰的出现得到证实。最终材料代表含有2-噁唑啉和磺酰胺单元的统计共聚物。

除了使用过量的保护芘酚磺酰氯确保PEI完全转化的程序外，还进行了PEtOx_0.77-共-PEI_0.23与不足量AcOPyrSO₂Cl的功能化。这样，少量阳离子PEI单元可以促进细胞摄取。P(EtOx-共-PEI-共-(HOPyr)SAz)的NMR谱在2.8 ppm处包含一个信号，表明存在剩余的PEI的CH₂-基团。

紫外/可见光谱研究

在光激发下，光酸可以进行激发态质子转移(ESPT)，导致与基态相比酸度显著提高。激发的质子化物质(ROH)将质子转移到氢键结合的水分子，形成激发的去质子化物质(RO^-)，其发射波长与ROH的发射波长不同。在4 M HCl中，没有聚合物光酸参与ESPT，因此吸收和发射光谱是ROH和ROH的特征信号。在pH 11.0时，基态分子主要是RO^-，而发射与RO^-相关。在中间pH 5.3时，聚光酸的吸收光谱在365和405 nm处有最大值，与在4 M HCl中记录的谱图相同，表明在基态时ROH是主要物种。有趣的是，所有聚合物都观察到双发射，最大值在445 nm(ROH)和525 nm(RO^-*)，表明ESPT至少部分有效。

为了确定聚光酸的pK_a，进行了pH计紫外-可见吸收滴定。随着缓冲溶液pH的增加，对应于ROH的405 nm波段减少，同时455 nm吸收波段增加，这是RO^-的特征。在455 nm处的吸光度对pH的图产生一条S形曲线。ROH和RO^-浓度相等的pH值是pK_a，对应于平均吸光度。观察到所得共聚物的pK_a从8.2增加到8.8。这种基态酸度的降低是由于芘酚含量增加导致共聚物疏水性增加的结果。使用F?rster循环分析确定共聚物的pK_a。对于所有聚合物光酸，ΔpK_a = pK_a - pK_a = -6.4，表明激发态酸度比基态增加。然而，观察到pK_a^*从1.8略微增加到2.4，表明增加芘酚含量引入的疏水性也影响聚合物光酸在激发态的酸度。

刺激响应行为

PEtOx基均聚和嵌段共聚物在水介质中的温度依赖性溶解度是众所周知的。此外，除了通过EtOx与其他2-噁唑啉的共聚调整T_cloud外，掺入pH或光响应共聚单体被广泛用于控制材料性能。芘酚在其电子基态可被视为疏水侧链。然而，在光激发下，ESPT可以发生，随着芘酚阴离子的形成，亲水性将增加，这将影响任何此类水溶液的浊点。除了这一点，芘酚的去质子化可以通过改变溶液pH来实现。从这一点来看，光酸单元具有优势，因为它们的极性可能受光和pH变化的影响。

这些假设通过浊度研究得到证实。在"原样"状态下，P(EtOx_0.97-共-(HOPyr)SAz_0.03)、P(EtOx_0.95-共-(HOPyr)SAz_0.05)、P(EtOx_0.89-共-(HOPyr)SAz_0.11)的水溶液表现出温度依赖性溶解度，浊点在30-60°C范围内，取决于磺酰叠氮啶单元的分数。降低pH值，从而质子化共聚物中的光酸单元，显著降低T_cloud，并且这种影响的严重程度对于具有最高光酸分数的P(EtOx_0.89-共-(HOPyr)SAz_0.11)降低。同时，在碱性条件下，相应的共聚物更亲水(更高电荷密度)，对于P(EtOx_0.95-共-(HOPyr)SAz_0.05)和P(EtOx_0.89-共-(HOPyr)SAz_0.11)的溶液，在pH 8时已经观察到高达85°C没有浊点。蓝光照射(405 nm)诱导的芘酚单元去质子化反过来导致T_cloud增加约3-5°C。

对于P(EtOx_0.77-共-PEI_0.06-共-(HOPyr)SAz_0.17)观察到特殊行为，在任何pH值下都没有观察到温度依赖性溶解度，这归因于在低pH下剩余PEI单元的质子化，也导致增加的亲水性。

水溶液中的自组装

通过动态光散射研究所得共聚物在水溶液中的聚集，表明大多数组合物是分子溶解的。P(EtOx_0.77-共-PEI_0.06-共-(HOPyr)SAz_0.17)在水溶液中的流体动力学半径R_h ≈ 17 nm。通过透射电子显微镜(TEM)对该样品的进一步研究揭示了球形聚集体的存在，这被解释为松散胶束。有趣的是，具有更高芘酚含量的共聚物在可比浓度下是分子溶解的，这表明这种聚集不仅仅由疏水相互作用驱动。根据文献，二乙胺的pK_a值(pK_aH = 11.2)和LPEI(pK_aH ≈ 9，确切值取决于相邻基团)略高于1-羟基芘单元的基态pK_a。这可能导致质子从PyrOH基团部分转移到相邻的PEI重复单元，形成PyrO^-和PEI-H⁺ interpolyelectrolyte complexes。然而，这种假设需要进一步深入的研究。

该溶液在可见光(LED 405 nm)照射15分钟导致R_h显著降低至~11 nm。随后照射2小时，以及移除光源(1小时)对R_h没有显著影响。水溶液中纳米粒子尺寸在光照下的变化应归因于羟基芘单元在激发态酸度增加。这反过来导致亲水-疏水平衡的变化和聚集体的潜在重组。

姜黄素的封装

两亲性共聚物被广泛用作封装和运输生物活性分子的工具。对外部触发器的响应以及聚集体结构或稳定性的最终变化为封装货物的释放提供了强大的控制机制。为了估计本文获得的聚光酸溶解疏水药物的能力，进行了以姜黄素作为模型抗癌药物的封装实验。通过溶剂交换从甲醇到水制备共聚物-姜黄素系统，目标聚合物浓度为3 mg/mL。通过离心去除任何未溶解的姜黄素，通过紫外-可见光谱和高效液相色谱控制负载能力。这里，P(EtOx_0.95-共-(HOPyr)SAz_0.05)和P(EtOx_0.89-共-(HOPyr)SAz_0.11)表现出相当差的负载能力，而具有最高芘酚含量的P(EtOx_0.77-共-PEI_0.06-共-(HOPyr)SAz_0.17)能够封装约48 mg每克共聚物，这与先前报道的Pox基嵌段共聚物数据相当。我们将P(EtOx_0.77-共-PEI_0.06-共-(HOPyr)SAz_0.17)的更高药物负载归因于纳米粒子的形成，这提供了更有效的疏水姜黄素溶解。

细胞摄取和细胞毒性

为了探究共聚物的一般细胞毒性作用，将A549和人胚胎肾(HEK293)细胞暴露于不同浓度的共聚物24小时，然后评估细胞活力。在所有测试浓度范围内，从0.01 mg/mL到0.3 mg/mL，共聚物导致两种细胞系的观察细胞活力超过90%。根据DIN EN ISO 10993-5标准，将细胞毒性定义为细胞活力≤70%，检查的共聚物在浓度高达0.3 mg/mL时表现出非细胞毒性行为。活细胞成像证实了两种共聚物在孵育24小时内被细胞吸收的能力。此外，共聚物没有引起任何可观察到的细胞形态改变。

为了监测活细胞中共聚物的摄取，将活HEK293细胞与所有共聚物在指示的时间点孵育。在405和442 nm激发下获取图像，并在450-527 nm范围内收集发射。大多数P(EtOx_0.77-共-PEI_0.06-共-(HOPyr)SAz_0.17)似乎在1小时内被细胞吸收。还观察到这种共聚物的一些聚集体，尽管在细胞外。发现剩余的共聚物在5小时内没有被细胞吸收。然而，这些共聚物的显著摄取可以在更长的孵育时间(24小时)实现。

结论

我们通过顺序CROP-水解-功能化合成策略报告了第一个基于聚(2-噁唑啉)的聚光酸。光谱研究证实获得的聚光酸经历激发态质子转移，ΔpK_a高达6.4。所得共聚物进一步在水溶液中表现出温度依赖性溶解度，范围从30°C到60°C，取决于总芘酚含量。此外，T_cloud可以通过蓝光照射增加3-5°C，并通过逐渐增加溶液pH直到共聚物完全溶解。DLS和TEM实验证实P(EtOx_0.77-共-PEI_0.06-共-(HOPyr)SAz_0.17)水溶液中存在纳米粒子，这可以初步解释为HOPyr基团和PEI单元之间的静电吸引，由于部分质子转移。进一步的DLS实验显示相应的R_h由于激发态质子转移在蓝光(405 nm)照射下减少。首次表明基于1-羟基芘的聚合物光酸对几种细胞系是非细胞毒性的。活细胞成像能够确认这些共聚物被细胞吸收的能力，进一步加强了观察到的非细胞毒性效应反映共聚物被内化并在细胞外的情况。最快的摄取速率(1小时内)观察到P(EtOx_0.77-共-PEI_0.06-共-(HOPyr)SAz_0.17)和具有最高芘酚含量的P(EtOx_0.78-共-(HOPyr)SAz_0.22)。除此之外，P(EtOx_0.77-共-PEI_0.06-共-(HOPyr)SAz_0.17)显示出模型疏水药物的高负载能力。鉴于上述结果，基于聚(2-噁唑啉)的聚光酸作为刺激响应药物载体具有巨大潜力。