PRRSV NSP5蛋白通过双重调控NLRP3炎症小体和STING通路介导免疫失衡的新机制

《Veterinary Research》：PRRSV NSP5 orchestrates dual immune disruption by targeting NLRP3 and STING

本研究揭示了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白NSP5通过双重机制介导免疫失衡：一方面招募NLRP3至内质网-线粒体界面，通过IP3R通道诱导Ca2+泄漏激活NLRP3炎症小体；另一方面滞留STING于内质网，阻断其向高尔基体转运，抑制I型干扰素(IFN-I)产生。该发现阐明了PRRSV"高炎症、低干扰素"免疫表型的形成机制，为抗病毒策略提供了新靶点。

　　

在病毒与宿主的军备竞赛中，免疫失衡已成为病毒逃逸宿主防御的重要策略。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)作为全球养猪业的头号威胁，感染后呈现典型的"高炎症、低干扰素"免疫特征，但这一现象背后的分子机制一直未被完全阐明。近日，Huang等人在《Veterinary Research》发表的研究首次揭示，PRRSV的非结构蛋白NSP5能够像"双面间谍"一样，同时操控炎症小体和干扰素两大免疫通路，为理解病毒免疫逃逸提供了全新视角。

研究人员首先通过体内外实验证实PRRSV感染确实能诱导猪肺泡巨噬细胞(PAMs)发生细胞焦亡(pyroptosis)，表现为典型的细胞肿胀、LDH释放增加以及IL-1β等炎性因子大量分泌。组织病理学分析显示，感染PRRSV的猪肺组织出现明显的肺泡间隔增厚和淋巴细胞浸润。

机制探索发现，NSP5通过其NACHT结构域与NLRP3直接相互作用，将NLRP3招募至内质网-线粒体界面。更为关键的是，NSP5能诱导内质网应激，通过IP3R离子通道引起Ca²⁺泄漏，进而激活NLRP3炎症小体。研究人员通过点突变筛选发现，NSP5的第30位甘氨酸(G30)和第35位天冬酰胺(N35)是激活NLRP3的关键残基。

另一方面，研究团队发现NSP5还能与内质网上的STING蛋白相互作用，阻止STING向高尔基体转运，从而抑制TBK1-IRF3磷酸化级联反应，最终阻断I型干扰素产生。即使使用STING激动剂diABZI刺激，NSP5过表达的细胞中IRF3仍滞留在胞质，无法核转位激活干扰素基因表达。

为验证这一双刃剑机制，研究人员利用反向遗传学技术成功构建了NSP5 G30A点突变病毒。与野生型病毒相比，G30A突变病毒感染PAMs后，NLRP3炎症小体激活程度显著降低，IL-1β分泌和LDH释放明显减少，且对IP3R抑制剂的敏感性下降，证实G30残基对NSP5的炎症激活功能至关重要。

本研究主要采用了以下关键技术方法：从4周龄SPF(无特定病原体)猪分离原代猪肺泡巨噬细胞(PAMs)建立感染模型；利用ASC斑点形成系统筛选病毒蛋白；通过共聚焦显微镜观察蛋白共定位；采用Co-IP(免疫共沉淀)验证蛋白相互作用；使用钙离子荧光探针Fluo-8检测胞质Ca²⁺水平；通过线粒体分离技术分析蛋白亚细胞定位；构建PRRSV感染性克隆进行点突变病毒拯救。

PRRSV感染激活NLRP3炎症小体

研究发现PRRSV感染能诱导NLRP3聚集和ASC斑点形成，免疫共沉淀证实感染后NLRP3-ASC-Caspase-1炎症小体复合物形成。使用NLRP3抑制剂MCC950和泛Caspase抑制剂Z-VAD能显著抑制PRRSV诱导的GSDMD切割和IL-1β释放。

NSP5招募NLRP3至内质网-线粒体界面

共聚焦显微镜显示NSP5主要定位于内质网，并能诱导NLRP3向线粒体转运。线粒体分离实验证实NSP5过表达后，NLRP3在线粒体组分中显著富集，表明NSP5通过重新定位NLRP3促进炎症小体组装。

NSP5通过IP3R诱导Ca²⁺泄漏

研究发现NSP5过表达能诱导内质网应激标志物GRP78表达上调，并引起胞质Ca²⁺水平升高。使用IP3R特异性抑制剂2-APB能有效抑制NSP5诱导的Ca²⁺泄漏、GSDMD切割和IL-1β分泌，而RyR抑制剂dantrolene无此效果。

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NSP5抑制STING介导的干扰素通路

即使使用STING激动剂diABZI刺激，PRRSV感染仍能显著抑制IFN-α分泌和TBK1-IRF3磷酸化。机制上，NSP5与STING直接结合，阻止其从内质网向高尔基体转运，从而中断下游信号传导。

本研究首次揭示了一个病毒蛋白通过双重机制调控宿主先天免疫的新范式：PRRSV NSP5一方面通过诱导Ca²⁺信号激活NLRP3炎症小体驱动过度炎症反应，另一方面通过滞留STING抑制I型干扰素产生，共同导致"高炎症、低干扰素"的免疫失衡状态。这一发现不仅阐明了PRRSV免疫逃逸的核心机制，也为开发靶向NSP5的新型疫苗和抗病毒策略提供了理论依据。更为重要的是，这种单个病毒蛋白同时调控炎症和干扰素通路的策略可能代表了病毒免疫逃逸的一种普遍机制，为理解其他病毒的致病机制提供了新思路。