伪结核棒状杆菌磷脂酶D靶向线粒体鞘磷脂通过NLRP3-GSDMD轴诱导巨噬细胞焦亡以促进感染的新机制

《Veterinary Research》：Corynebacterium pseudotuberculosis phospholipase D targets mitochondrial sphingomyelin and induces NLRP3-GSDMD axis-mediated pyroptosis in macrophages to promote infection

本研究针对伪结核棒状杆菌(Cp)如何逃逸巨噬细胞并传播这一关键科学问题，揭示了其关键毒力因子磷脂酶D(PLD)通过靶向巨噬细胞线粒体鞘磷脂(SM)，诱导线粒体心磷脂(CL)外翻和活性氧(mtROS)释放，进而激活NLRP3-GSDMD轴介导的焦亡，从而促进细菌逃逸和播散。该发现阐明了Cp感染的新致病机制，为控制该人畜共患病原体提供了新的潜在靶点（抑制焦亡）。

　　

在畜牧业中，由伪结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis, Cp)引起的慢性炎症性疾病，如干酪性淋巴结炎，造成了严重的经济损失。这种兼性胞内细菌能够入侵并在巨噬细胞——这道免疫防御的重要关卡——内存活，甚至最终杀死这些细胞，但其具体机制一直笼罩在迷雾之中。传统的细胞死亡方式，如凋亡和自噬，似乎并非Cp杀死巨噬细胞的主要手段，那么它究竟是如何突破重围，成功逃逸并感染新的细胞，从而实现体内传播的呢？这个问题是理解Cp致病机制和开发有效控制策略的关键。

以往的研究表明，Cp分泌的一种关键外毒素——磷脂酶D(Phospholipase D, PLD)，对于其在宿主体内的持久存在和传播至关重要。然而，PLD是否以及如何参与Cp诱导的巨噬细胞死亡过程，仍然是一个未解之谜。近年来，一种名为“焦亡”(pyroptosis)的程序性细胞死亡方式引起了科学家的广泛关注。焦亡是一种促炎性的细胞死亡，其特征是细胞膜破裂、细胞内容物泄漏以及乳酸脱氢酶(LDH)和白细胞介素-1β(IL-1β)等炎症因子的释放。在病原体感染中，焦亡扮演着双重角色：一方面，它可以通过清除被感染的细胞和引发炎症来保护宿主；但另一方面，一些狡猾的病原体，如白色念珠菌和结核分枝杆菌，却能“劫持”焦亡途径，将其作为从巨噬细胞中逃逸并进一步传播的“特洛伊木马”。那么，Cp是否也利用了类似的策略？PLD在其中又扮演了什么角色？这些问题激发了研究人员的浓厚兴趣。

为了回答这些问题，发表在《Veterinary Research》上的这项研究开展了一系列深入的探索。研究人员首先证实了Cp感染确实能够诱导巨噬细胞发生焦亡，表现为LDH释放增加、细胞膜完整性破坏（碘化丙啶PI摄取）以及焦亡执行蛋白GSDMD被切割成有活性的N端片段(GSDMD-N)。更重要的是，他们发现抑制焦亡（使用抑制剂双硫仑DSF或富马酸二甲酯DMF）能够降低Cp感染小鼠的死亡率，并阻止细菌从受感染的巨噬细胞中逃逸。相反，使用脂多糖LPS来“助推”炎症反应，则会加剧小鼠的死亡。这初步表明，焦亡是Cp用来促进自身感染和传播的一个“工具”。

那么，Cp是如何触发焦亡的呢？研究人员将目光投向了关键毒力因子PLD。通过比较野生型Cp(XH02)和PLD基因敲除菌株(XH02△pld)的感染实验，他们发现PLD是诱导巨噬细胞焦亡所必需的。在PLD缺失的情况下，焦亡的关键指标（如LDH释放、IL-1β分泌、GSDMD切割）均显著减弱。更有力的证据是，当研究人员直接在巨噬细胞内表达PLD蛋白时，即使没有细菌感染，也足以成功诱发焦亡。进一步的机制探索揭示，PLD诱导焦亡依赖于NLRP3炎症小体-GSDMD这条信号轴。因为在使用CRISPR-Cas9技术构建的Nlrp3^-/-和Gsdmd^-/-巨噬细胞中，Cp感染或PLD表达所引发的焦亡被显著抑制了。

接下来的问题是，PLD是如何激活NLRP3-GSDMD轴的呢？研究的创新性发现在于揭示了线粒体是PLD攻击的关键细胞器。研究人员发现，Cp感染会导致巨噬细胞线粒体功能严重紊乱，表现为线粒体膜电位下降、线粒体活性氧(mtROS)水平升高以及线粒体网络结构被破坏，而这一切都依赖于PLD的存在。他们证实，PLD进入巨噬细胞后，其攻击的靶点并非细胞膜上的鞘磷脂(Sphingomyelin, SM)，而是线粒体上的鞘磷脂。PLD水解线粒体鞘磷脂，导致位于线粒体内膜的心磷脂(Cardiolipin, CL)外翻到线粒体外膜，并释放mtROS，这些线粒损伤信号最终汇聚到NLRP3炎症小体的激活上。抑制mPTP（线粒体通透性转换孔）开放、清除mtROS或抑制ATP生成，都能减轻Cp诱导的焦亡和细菌逃逸，证明了线粒体损伤在此过程中的核心地位。

研究还通过分子对接和点突变实验，确定了PLD酶活性对其致焦亡功能至关重要，D66、G80、K114、G242等位点是其发挥功能的关键活性位点。相应的突变体PLD不仅与鞘磷脂的结合能力下降，其诱导焦亡和致病的能力也大大减弱。

在技术方法层面，本研究综合运用了多种关键技术来验证科学假设。研究团队构建了Cp的PLD基因缺失株(XH02△pld)、回补株(XH02△pld:pld)和PLD酶活性位点突变株(XH02△pld:mpld)，并纯化了重组PLD(rPLD)及其突变体蛋白。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得了Nlrp3^-/-和Gsdmd^-/-的巨噬细胞系。细胞感染模型采用小鼠腹腔巨噬细胞(PMs)和J774A.1巨噬细胞系，通过乳酸脱氢酶(LDH)释放检测、Western blot分析、免疫荧光、线粒体膜电位(JC-1)和mtROS(MitoSOX)检测、透射电子显微镜观察等手段评估细胞焦亡和线粒体功能。通过细菌逃逸和扩散实验（包括菌落计数、荧光显微镜和流式细胞术）评估细菌的胞内命运。此外，还使用了线粒体分离、鞘磷脂含量测定、心磷脂外翻检测（Annexin V结合法）、分子对接等技术深入探索分子机制。小鼠感染模型则用于在体验证焦亡和PLD在Cp致病过程中的作用。样本队列包括C57BL/6野生型小鼠、Nlrp3^-/-基因敲除小鼠和昆明小鼠。

PLD促进Cp从受感染的巨噬细胞中逃逸

研究通过细菌入侵和逃逸实验发现，PLD并不影响Cp入侵巨噬细胞的初始能力（1小时细胞内菌量无差异），但显著促进了感染后期（12小时）细菌从细胞内向培养上清液的释放，以及细菌向周围新巨噬细胞的扩散。使用Gly或抗NINJ1抗体抑制焦亡终末阶段的细胞膜破裂(PMR)，同样能减少细菌的扩散，表明PLD是通过诱导焦亡来为Cp的逃逸打开“通道”。

PLD是Cp感染引起巨噬细胞线粒体功能障碍的关键

通过MitoSOX和JC-1染色、线粒体网络结构（TOM20染色）和超微结构观察（透射电镜），研究证实PLD是导致Cp感染后巨噬细胞mtROS爆发、线粒体膜电位崩溃、线粒体嵴结构破坏甚至线粒体破裂的主要原因。

PLD通过NLRP3-GSDMD轴诱导巨噬细胞焦亡

在Nlrp3^-/-或Gsdmd^-/-巨噬细胞中，无论是Cp感染还是细胞内PLD表达所引发的焦亡（LDH释放、IL-1β分泌、GSDMD切割）均被显著抑制。同时，细菌在基因敲除细胞中的扩散能力也明显减弱，确证了NLRP3-GSDMD轴在PLD诱导的焦亡及细菌传播中的不可或缺性。

多个酶活性位点对PLD诱导焦亡至关重要

分子对接显示，PLD通过氢键和疏水作用与鞘磷脂结合，而D66S, G80I, K114N, W242P等点突变降低了其结合亲和力。相应的突变体PLD在诱导巨噬细胞焦亡、线粒体膜电位下降以及小鼠体内IL-1β水平和致病性方面，均弱于野生型PLD。鞘磷脂水解抑制剂GW4869也能抑制PLD诱导的焦亡，进一步证明其酶活性是关键。

PLD靶向线粒体鞘磷脂并诱导线粒体心磷脂外翻

研究有一个关键发现：Cp感染后，巨噬细胞线粒体组分中的鞘磷脂水平显著下降，而细胞膜上的鞘磷脂水平无变化。重组PLD能直接降解分离的线粒体上的鞘磷脂。更重要的是，PLD的活性导致了线粒体心磷脂从内膜外翻至外膜（通过Annexin V结合检测）。有趣的是，心磷脂外翻不依赖于NLRP3，但在Gsdmd^-/-细胞或用DSF抑制GSDMD后，心磷脂外翻反而增强，提示GSDMD可能对心磷脂外翻有反馈调节作用，具体机制有待进一步研究。

综上所述，本研究得出结论：Cp通过其关键毒力因子PLD，巧妙地利用巨噬细胞的焦亡机制为自身传播开辟道路。具体机制是：Cp感染上调巨噬细胞NLRP3等焦亡相关分子的表达（启动信号）；随后，细菌分泌的PLD靶向并水解巨噬细胞线粒体上的鞘磷脂，导致线粒体损伤，表现为心磷脂外翻和mtROS释放（激活信号）；这些线粒体损伤信号进而激活NLRP3炎症小体，活化的caspase-1切割GSDMD产生GSDMD-N，后者在细胞膜上形成孔洞，导致细胞发生焦亡性破裂，最终使Cp得以逃逸并感染新的细胞。

这项研究的科学价值在于首次系统地阐明了Cp利用PLD诱导巨噬细胞焦亡从而促进自身逃逸和传播的完整分子通路，特别是创新性地发现了PLD的作用靶点是线粒体鞘磷脂，并将线粒体损伤、心磷脂外翻与NLRP3-GSDMD轴激活联系起来。这不仅深化了对Cp致病机制的理解，也为开发针对Cp感染的新防控策略提供了理论依据，例如靶向PLD的酶活性、抑制NLRP3炎症小体或焦亡通路，可能成为控制这种重要人畜共患病原体的有效手段。研究结果发表于《Veterinary Research》期刊。