SLC45A2基因错义突变导致德克斯特牛隐性毛色稀释的新发现及其在黑色素合成通路中的作用

《Animal Genetics》：A recessive coat color dilution in Dexter cattle attributed to a missense mutation in SLC45A2

本研究在德克斯特牛中发现一种由SLC45A2基因错义突变（c.398A>C, p.Gln133Pro）引起的隐性毛色稀释表型，该突变通过影响黑色素体pH值调控机制，导致酪氨酸酶（TYR）活性降低，从而解释巧克力色（CD）和奶油色（CL）毛色的形成机制，为动物毛色遗传学研究提供了新靶点。

　　

摘要

目前德克斯特牛中公认有三种毛色：黑色、红色和暗褐色。在德克斯特牛中，暗褐色是由酪氨酸酶相关蛋白1（TYRP1）基因的隐性基因型（b/b）决定的，该基因型会稀释原本为黑色的动物（黑素皮质素1受体（MC1R）基因型为ED/?）；这种变异不影响红色牛只。研究鉴定出一部分德克斯特牛具有稀释毛色，被描述为深暗褐色/巧克力色（CD）或浅暗褐色/奶油色（CL）。尽管它们与暗褐色表型相似，但并不具有预期的TYRP1 b/b基因型。根据所报道个体间的亲缘关系，研究人员提出假设，认为一种新的隐性基因型是导致黑色背景上出现CD和红色背景上出现CL的原因。对四头稀释毛色德克斯特牛（三头CD和一头CL）以及一头CD母牛所产的黑色犊牛进行了全基因组测序。所有测序的牛均不具有TYRP1 b/b基因型。将五头德克斯特牛的变异与226头非德克斯特对照牛的变异进行比较后，鉴定出溶质载体家族45成员2（SLC45A2）基因中的一个错义变异（NC_037347.1: g.39790189A>C; XM_002696386.6: c.398A>C），该变异符合提出的假设。对更多德克斯特牛（n = 227）进行的桑格测序表明，该隐性基因型与CD和CL表型完全共分离。该突变预计会导致跨膜螺旋中的谷氨酰胺被脯氨酸取代（XP_002696432.2: p.Gln133Pro），并被SIFT预测为有害。进一步支持其关联性的是，SLC45A2基因在多个物种中负责毛色稀释和IV型眼皮肤白化病。对SLC45A2变异的检测可为对毛色感兴趣的德克斯特牛育种者提供宝贵资源。

引言

德克斯特牛起源于19世纪的爱尔兰南部，在20世纪初有超过200头被引入北美。该品种最初被认为是凯里牛和德文牛的一个分支，尽管遗传证据表明只有历史上培育的德克斯特牛显示出凯里牛的显著影响。这两个品种都是凯尔特黑牛的后代。鉴于其相对较小的体型（成年身高通常低于1.2米）、耐寒性和双重用途，德克斯特牛现已遍布全球。在美国德克斯特牛协会和其他德克斯特牛登记机构中，该品种公认的毛色包括黑色、红色和暗褐色。对毛色感兴趣的德克斯特牛育种者可以对其牛进行基因分型，以分类黑素皮质素1受体（MC1R）和酪氨酸酶相关蛋白1（TYRP1）两个基因的变异，从而确定它们可能携带的颜色变体。

在牛中，MC1R延伸位点是毛色的主要决定因素。一个单点突变从参考等位基因（E+）产生显性黑色（ED/?），这解释了德克斯特牛中的黑色被毛。两个拷贝的单碱基对框移缺失导致隐性红色（e）。在MC1R位点缺乏ED等位基因的德克斯特牛被报告为并呈现红色。当TYRP1基因的德克斯特特异性基因变体（b/b）的两个拷贝存在于黑色背景（MC1R ED/?）上时，被毛被稀释为暗褐色表型。TYRP1突变对原本为红色的牛没有影响。在本研究中，缺乏暗褐色TYRP1隐性基因型的德克斯特牛被报告具有意想不到的深暗褐色/巧克力色（CD）或浅暗褐色/奶油色（CL）被毛颜色。本研究的目标是鉴定这些毛色的遗传基础。根据观察到的遗传模式，研究人员假设一种新的隐性基因型是导致黑色背景上出现CD和野生型或红色背景上出现CL的原因。

材料与方法

样本采集

总共收到来自澳大利亚（n = 39）、加拿大（n = 4）、欧洲（n = 85）和美国（n = 99）的227份德克斯特牛样本。样本分为三种类型：EDTA抗凝全血（n = 1）、毛发（n = 212）和精液（n = 14）。

DNA提取

使用Gentra Puregene Blood Core Kit B（Qiagen，荷兰芬洛）并采用改良方案从EDTA抗凝全血和精液中分离DNA。使用Quick-DNA Miniprep或Microprep Plus Kit（Zymo Research，美国加利福尼亚州欧文）按照制造商方案从毛囊中分离DNA。使用Epoch 2微孔板读数仪（BioTek，美国佛蒙特州温努斯基）对DNA进行定量。

全基因组测序

将来自三头CD德克斯特牛、一头CD母牛所产的黑色犊牛和一头CL阉牛的分离DNA送至Admera Health（美国新泽西州南普莱恩菲尔德）进行KAPA Hyper Prep文库制备（Roche）和Illumina NovaSeq 150 bp双末端全基因组测序，目标深度为每个个体15×。使用TrimGalore处理原始数据，修剪接头并去除低质量碱基。使用BWA-MEM将读数映射到ARS-UCD1.2基因组，并使用SAMtools标记重复序列。使用GATK进行indel重排，并使用GATK Haplotype Caller进行变异调用。将五头德克斯特牛的数据与先前从其他项目测序的226头多品种对照牛的数据合并成一个联合变异调用文件（VCF）。最初，使用SnpSift过滤数据，以鉴定4头CD/CL牛具有替代等位基因，而同时假设来自其他品种的对照牛仅具有参考等位基因的位点。对于任何偏离CD母牛与其黑色后代预期遗传模式的位点，使用Integrative Genomics Viewer进行进一步研究；不正确的基因型被更正或酌情标记（例如，低读数深度导致可能的杂合子遗漏）。无法解析的位点被排除在考虑之外。VCF被进一步过滤，要求CD/CL牛中为纯合替代等位基因，并且CD后代为杂合子，符合隐性表型的预期。使用Ensembl Variant Effect Predictor（VEP）评估预测的变异影响。假设致病变异是德克斯特牛特有的，并且在品种内相对罕见，因此先前在NCBI参考序列数据库（RefSeq）中报道过的变异被认为不太可能是致病性的，并从考虑中排除。对没有RefSeq标识符的变异，在243头牛的公共WGS数据中进行了查询，其中包括四头德克斯特牛。还在密苏里大学维护的包含5500多头牛的数据库中查询了这些变异的存在和频率。使用SIFT和PolyPhen2评估最终候选变异的预测功能。使用NIH NCBI蛋白质blast比对工具评估跨多个物种的氨基酸保守性。使用UniProt和DeepTMHMM研究感兴趣变异在蛋白质中的位置。

桑格测序

在黑素皮质素1受体（MC1R）、酪氨酸酶相关蛋白1（TYRP1）和溶质载体家族45成员2（SLC45A2）的毛色变异位点设计引物。PCR反应体积为12 μL，包含4 μL 5 ng/μL DNA，0.75 μL 20 μM正向引物，0.75 μL 20 μM反向引物，4.45 μL MilliQ水，0.25 μL 25 mM MgCl₂，1.2 μL 含20 mM MgCl₂的10× PCR反应缓冲液，0.5 μL PCR核苷酸混合物，和0.1 μL 5 U/μL FastStart Taq DNA聚合酶（来自Roche FastStart kit，Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）。PCR循环条件如下：94°C 4分钟，然后进行32个循环：94°C 30秒，退火温度（见表S1）30秒，72°C 45秒，最后72°C延伸10分钟，然后保持在10°C。在1.2%琼脂糖凝胶上检查PCR产物后，将3 μL PCR产物加入0.75 μL ExoSAP-IT（Applied Biosystems，美国加利福尼亚州福斯特城）和13.25 μL MilliQ水中。纯化条件如下：37°C 30分钟，80°C 15分钟，然后保持在15°C。在送至Eurofins Genomics（美国肯塔基州路易斯维尔）进行ABI 3730 xl桑格测序之前，加入2 μL 20 μM引物。使用Sequencher 5.4.6（Gene Codes Corporation，美国密歇根州安娜堡）分析测序结果。

结果

全基因组测序

WGS数据处理后，五个样本的平均覆盖深度达到13.5×（范围13.2–13.9×）。过滤仅保留存在于CD/CL牛中而不存在于非德克斯特对照牛中的变异，初步鉴定出170个候选变异。Integrative Genome Viewer分析去除了八个不符合CD母牛与黑色后代之间孟德尔遗传预期的位点。所有剩余的162个变异都位于20号染色体（NC_037347.1）上一个1.8 Mb的片段内，其中161个符合假设的隐性遗传模式（见表S3）；142个是已知变异（RefSeqGene）。当对剩余的19个没有先前注释的变异（见表S4）查询密苏里大学的WGS数据库时，除六个外，其余均存在于多个其他品种中；有两个不存在于任何其他牛中（见表1）。在这两个变异中，只有溶质载体家族45成员2（SLC45A2）基因的变异预测会对基因功能产生影响。

表1. 在其他牛中未观察到的候选变异。

染色体	位置 (bp)	参考等位基因	替代等位基因	变异注释	基因ID
20	38,156,214	TC	T	内含子区	UGT3A2
20	39,790,189	A	C	错义变异	SLC45A2

对另外222份德克斯特牛DNA样本进行了桑格测序，以对SLC45A2变异以及MC1R（ED, E+, e, ev1, ev2）和TYRP1（见图S1）的已知变异进行基因分型（见表2；表S5）。基因分型证实，所有表型描述为暗褐色或巧克力色的德克斯特牛，要么是已知TYRP1变异（b/b）的纯合子，要么是新发现的SLC45A2变异（NC_037347.1: g.39790189A>C）的纯合子，并且在MC1R位点至少存在一个ED等位基因（基础颜色=黑色）。被鉴定为奶油色的六头德克斯特牛在MC1R位点为E+/E+、E+/e或e/e基因型，并且是SLC45A2变异的纯合子。

表2. 候选SLC45A2变异以及德克斯特牛已知毛色变异MC1R和TYRP1的桑格测序和全基因组测序结果。

（表格内容详见原文，此处概括关键信息：所有巧克力色（CD）牛均为SLC45A2 C/C纯合，且MC1R为ED/?；所有奶油色（CL）牛均为SLC45A2 C/C纯合，且MC1R非ED/?（即E+/?或e/e）；所有暗褐色（Dun）牛均为TYRP1 b/b纯合，且MC1R为ED/?；黑色和红色对照牛均非SLC45A2 C/C纯合。）

预测对蛋白质功能的影响

牛SLC45A2基因位于ARS-UCD1.2基因组的20号染色体上，跨度2.3 kb。在SLC45A2基因第1外显子中发现的错义变异（XM_002696386.6: c.398A>C）预计会导致谷氨酰胺被脯氨酸取代（XP_002696432.2: p.Gln133Pro），该位点位于UniProt注释为螺旋跨膜结构域的区域内。DeepTMHMM进一步明确该残基位于12个跨膜结构域中的第二个。该突变被SIFT归类为有害，评分为0.01；被PolyPhen-2归类为可能有害，评分为0.999。SLC45A2氨基酸序列比对表明，该变异位点在所分析的所有物种中都是保守的（见图S1）。

讨论

在德克斯特牛中发现了一种与先前鉴定的TYRP1暗褐色稀释无关的新型SLC45A2隐性变异，该变异导致稀释毛色。CD和CL牛与具有TYRP1基础暗褐色稀释的牛在表型上的相似性，可能是其先前在群体中未被发现的原因。SLC45A2变异在所有研究的、被归类为稀释毛色但不具有TYRP1 b/b基因型的德克斯特牛中完全共分离。在任何非稀释毛色的牛中均未鉴定出SLC45A2的隐性纯合基因型。作为其与这些牛毛色关联的进一步支持，SLC45A2蛋白（也称为膜相关转运蛋白或从免疫选择黑色素瘤中分离的抗原1）至少在18个其他物种中参与调节被毛、眼睛和皮肤颜色（OMIA: SLC45A2 (606202)）。然而，每种变异对被毛或毛发颜色的影响各不相同。例如，人类SLC45A2基因的突变可导致毛发颜色从白色到棕色不等。在马中，SLC45A2基因第2外显子的一个错义突变导致杂合子中红色色素部分稀释为奶油色表型（"奶油"稀释），而纯合子则导致黑色色素稀释并进一步稀释红色色素。马中与珍珠毛色相关的颜色稀释需要SLC45A2致病变异的纯合性，这与在德克斯特SLC45A2变异中观察到的机制一致。本研究的一个意外结果是，在德克斯特牛样本中鉴定出MC1R的ev1等位基因。据研究人员所知，该变异先前未在该品种中被描述过，尽管首次描述该变异的出版物指出其在16个欧洲品种中存在，但通常频率较低。

在发育过程中，成黑素细胞迁移到身体的各个区域，其中一些发育成毛囊中的黑素细胞。黑素细胞内的黑素体产生黑色素的混合物，包括真黑素（黑褐色）或褐黑素（红黄色），并为生长的毛干提供色素。在黑色牛中，α-黑素细胞刺激激素与G蛋白偶联受体MC1R结合，启动下游cAMP依赖性信号通路，以调节黑素细胞内小眼畸形相关转录因子（MITF）的产生。MITF然后结合与色素沉着相关的基因，例如酪氨酸酶（TYR）、多巴色素互变异构酶（DCT）和TYRP1。MITF通过间接调控机制作用于SLC45A2。

TYR和TYRP1从反面高尔基体网络运输到未成熟黑素体的膜上。在黑素体内，复杂的生化途径将酪氨酸转化为黑色素，始于TYR将酪氨酸羟基化为3,4-二羟基苯丙氨酸（多巴）。TYR的酶活性需要pH介导的铜离子结合，并且在接近中性pH时活性最佳。SLC45A2是一种属于质子/葡萄糖协同转运蛋白家族的次级主动转运蛋白，定位于成熟黑素体的外膜亚域。SLC45A2转运蛋白在黑素体生成III-IV期将质子和糖分子从黑素体腔排出到细胞质中，主动提高pH值。研究人员假设本研究中发现的变异影响了SLC45A2的转运功能，导致pH更酸性，从而降低酪氨酸酶活性，导致黑色素合成减少。

与SLC45A2类似，TYRP1也调节TYR活性，但机制不同。TYRP1与DCT一起稳定TYR的催化功能，正向调节TYR向黑素体的有效靶向，并且在5,6-二羟基吲哚-2-羧酸-黑色素生产途径中很重要。德克斯特特异性TYRP1变异仅对真黑素牛产生表型影响，可能是由于补偿途径、冗余基因或其特异性在5,6-二羟基吲哚-2-羧酸-黑色素合成中的作用。在人类黑素细胞中敲低SLC45A2显示黑素体停滞在II期，这表明SLC45A2对真黑素和褐黑素合成的影响比TYRP1更早，这可能解释了其对黑色和红色牛均产生影响的原因。

在本研究中，没有牛同时是SLC45A2和TYRP1稀释基因型的纯合子。鉴于这两个基因的功能不同，两种变异的同时存在是否会导致黑色背景牛出现更极端的被毛颜色稀释值得关注。此外，SLC45A2突变会导致发育性眼部异常（IV型眼皮肤白化病），包括犬类、一只大猩猩以及人类中的许多病例。在布朗维赫牛中，在两个患有眼皮肤白化病的同父异母犊牛中鉴定出SLC45A2基因的两个突变。据主人描述，具有CD/CL或TYRP1-暗褐色表型的德克斯特牛表现出稀释的（淡褐色或金色）眼色素，但据研究人员所知，尚未有报道称它们的视力存在问题。这一观察结果为未来研究这些变异如何改变稀释毛色德克斯特牛的眼部特征提出了额外的问题。

作者贡献

Anna M. Fuller：调查研究；撰写初稿；方法论；验证；可视化；形式分析；数据管理。Carol Davidson：概念化；资源提供。Jessica L. Petersen：调查研究；资金获取；撰写审阅和编辑；方法论；项目管理；监督。

致谢

德克斯特牛育种者Carol Davidson（1941-2023）自称为"好奇心基因的纯合子"。这项研究能够成功，完全归功于她对品种的热爱、敏锐的观察力、深思熟虑的样本收集和科学好奇心。作者感谢所有贡献样本和照片的德克斯特牛主人和育种者，特别感谢Wakarusa Ridge Ranch、PorcPrunus Dexters和Carragheen Dexter Stud。我们感谢密苏里大学的合作者Robert Schnabel分享其数据库中候选变异的等位基因频率。部分研究是使用内布拉斯加大学霍兰计算中心进行的，该中心得到内布拉斯加研究计划的支持。

资金来源

本项目由Wakarusa Ridge Ranch、美国德克斯特牛协会和Carol Davidson遗产资助。

利益冲突声明

加州大学戴维斯分校兽医遗传学实验室可提供该变异的检测服务，该实验室可能会在一段有限的时间内将部分检测收益作为实物研究支持或其他形式的报酬提供给Petersen实验室。

伦理声明

所有程序均遵守内布拉斯加大学林肯分校机构动物护理和使用委员会的指导方针。无需委员会批准，因为所有样本均由动物主人收集和提供。