台湾-琉球岛弧苔藓栖息跳甲（鞘翅目：叶甲科：跳甲亚科）的复杂演化与生物地理历史

《Systematic Entomology》：Complex evolution and biogeographic history of moss-inhabiting flea beetles from the Taiwan-Ryukyu Island Arc (Coleoptera: Chrysomelidae: Alticini)

本研究通过基因组学数据（ddRAD测序获得1649个核基因座，50,461个SNPs）揭示了栖息于苔藓的跳甲属（Ivalia）在台湾-琉球岛弧的复杂演化史。研究发现了由中新世晚期隔离分化与上新世从台湾扩散事件共同塑造的生物地理格局，并在台湾岛内识别出一次大规模的物种辐射（Ivalia uenoi复合群）。研究结果凸显了线粒体与核基因组数据间的显著不一致性（有丝分裂核 discordance），这可能导致基于线粒体DNA条形码（cox1）的物种界定错误，而基于核标记的物种界定结果则与形态学检查相符。此外，研究还发现了古代核基因渐渗（introgression）的迹象。这项研究强调了综合分类学框架在昆虫系统学中的关键作用。

　　

引言

岛屿是研究物种多样化、物种形成和生物地理学的绝佳模型系统。岛屿物种的进化起源主要有两种情景：隔离分化（vicariance）和扩散后异域成种（allopatric speciation following dispersal）。素有“东方加拉帕戈斯”之称的台湾-琉球岛弧是东亚岛屿生物多样性研究的关键区域之一，拥有许多著名的特有物种。该岛弧的地质历史和古地理仍存在相当大的不确定性。台湾-琉球岛弧的动物区系深受隔离分化和扩散事件的影响。飞行能力的丧失是促进昆虫（尤其是甲虫）物种辐射的关键特征之一。飞行能力丧失的甲虫扩散能力有限，但常在热带山脉和群岛中形成微特有物种的辐射，偶尔的扩散事件会扩展其分布范围并随后导致物种形成。苔藓栖息跳甲（Coleoptera: Chrysomelidae: Galerucinae: Alticini）是未被充分研究且具有复杂演化历史的飞行甲虫的一个有趣例子。在亚洲，大多数已知的苔藓栖息跳甲谱系属于所谓的Chabria属群，其中物种最丰富的属是Ivalia Jacoby，分布在从斯里兰卡、印度到日本、新几内亚和澳大利亚的东洋区。

材料与方法

样品采集

为了获得代表性样本，研究人员在整个台湾和琉球群岛（西表岛、石垣岛、冲绳岛、冲永良部岛和奄美大岛）采集了Ivalia标本。数据集共包含来自18个采集点的样本。除了一个例外，研究人员汇集了分布在台湾和琉球群岛的所有已知Ivalia物种。此外，还汇集了一组来自台湾的12个未描述形态种的Ivalia。总共检查了76个标本，并包括两个外群。

DNA条形码和桑格测序

从整个标本中提取基因组DNA。使用细胞色素c氧化酶亚基1（cox1）通用条形码引物LCO/HCO进行PCR扩增和桑格测序，以获得DNA条形码。为了重建台湾和琉球群岛Ivalia的分化时间，还额外测序了几个标本的cox1基因5'部分、线粒体16S rRNA基因以及核蛋白编码基因CAD和wingless（wg）。

ddRAD文库制备和测序

选择具有足够浓度和包含长DNA片段的DNA提取物进行ddRAD文库制备。使用限制性内切酶EcoRI和MspI进行消化，然后进行接头连接、扩增和测序。

ddRAD数据处理

使用iPyrad从头组装ddRAD基因座的双端读数。用于系统发育分析的最终数据集包含1649个串联的基因座，共有50,461个单核苷酸多态性（SNPs）。

系统发育分析：条形码和ddRAD

基于mtDNA条形码数据集（cox1）和由串联ddRAD基因座组成的核数据集进行系统发育分析，以重建台湾和日本Ivalia的系统发育关系并评估物种多样性。使用MrBayes进行贝叶斯系统发育分析，使用IQtree进行最大似然（ML）系统发育分析。

物种界定

基于DNA条形码，使用自动条形码间隙发现（ABGD）方法分析cox1条形码比对。基于核遗传数据，使用分支切割（bcut）算法分析从核基因座数据集推断的ML树来进行物种界定。此外，还使用bPTP和ASAP方法进行了物种界定分析，并使用BPP软件在multispecies coalescent模型下进行了物种界定。

分化时间估计

使用BEAST2估计台湾和日本Ivalia内的分化时间。构建了两个数据集进行时间树估计：smalltree数据集和speciestree数据集。smalltree数据集基于两个线粒体（16S, cox1）和两个核（CAD, wingless）基因座，用于估计台湾和日本Ivalia开始多样化的时间。speciestree数据集基于ddRAD基因座，用于估计Ivalia物种的分化时间。

祖先生物地理分布范围估计

使用BioGeoBEARS软件包重建生物地理情景。将研究范围划分为4个区域：台湾（T）、八重山群岛（Y）、冲绳岛（包括冲永良部岛）（O）和奄美大岛（A）。进行了两组独立的分析：非约束性分析和约束性分析。

群体遗传学和基因渐渗检测

使用STRUCTURE软件测试Ivalia样本的遗传聚类。使用Dsuite软件进行ABBA-BABA测试以检测Ivalia多样化过程中潜在的基因渐渗事件。

结果

基于线粒体条形码的系统发育和物种界定

cox1数据集包含分布在台湾和琉球群岛的65个Ivalia标本和两个外群。贝叶斯系统发育分析显示，数据集中最祖先的分化由来自奄美大岛的日本物种Ivalia kodama代表，它构成了所有其他台湾-日本物种的姐妹群。其余的日本物种（I. nakanoi和I. variabilis）形成了一个深嵌于台湾Ivalia中的支系，是单系的Ivalia uenoi物种复合群的姐妹群。ABGD物种界定在数据集中发现了12个mtDNA物种谱系。然而，雄性生殖器和外部形态的检查显示，ABGD界定的几个物种包含多个差异显著的形态种。bPTP和ASAP分析的结果也与形态种概念存在不一致。总之，研究人员检测到DNA条形码提出的物种概念与传统分类学方法提出的形态种之间存在不一致。

核DNA系统发育和物种界定

ddRAD基因座的从头组装最终保留了1649个基因座用于系统发育分析。与mtDNA拓扑结构一致，核ML系统发育分析将来自奄美大岛的Ivalia kodama确定为所有其他物种的姐妹谱系。其余的日本物种I. nakanoi和I. variabilis深嵌于台湾Ivalia中。与cox1树相反，I. bella作为I. nakanoi和I. variabilis的姐妹群聚集在一起。分支切割物种界定分析将所有四个物种支持为不同的分子操作分类单元（MOTUs）。在Ivalia uenoi物种复合群内，观察到与cox1系统发育相比强烈的拓扑结构不一致。分支切割分析将该复合群细分为11个MOTUs，与提出的形态种相匹配。BPP物种界定分析在两组先验设置下均得到一致的结果，强烈支持分支切割算法推断的物种边界。

分化时间估计和生物地理制图

对smalltree数据集进行的两次独立BEAST2运行对台湾-日本Ivalia的冠部年龄以及Ivalia和Parathrylea之间的分化时间给出了非常相似的估计。speciestree分析显示台湾-日本Ivalia的冠部分化时间更早，可追溯到中新世晚期。I. uenoi物种复合群中最深的分化估计发生在中新世-上新世边界。I. uenoi物种复合群中的大多数分化，以及I. bella、I. nakanoi和I. variabilis之间的分化，被揭示发生在上新世，只有I. uenoi复合群中最年轻的分化可追溯到更新世。

BioGeoBEARS分析比较了两组模型（有和无由j参数表示的跳跃扩散），每组模型又分别进行空间约束（仅允许相邻岛屿间扩散）和非约束分析。除BAYAREALIKE+j模型外，约束组中的所有模型都获得了较低的AIC分数，表明约束情景更符合数据。最低的AIC分数是在空间约束情景下的DIVALIKE+j模型下发现的，因此被认为是最佳拟合模型。DIVALIKE+j模型揭示了台湾-日本Ivalia最祖先的分布范围是奄美和台湾的组合。由于最基础的分化时间估计为中新世晚期，早于琉球群岛作为岛屿的形成，研究人员认为奄美大岛+台湾的祖先范围实际上相当于中新世晚期的亚洲大陆。该模型随后估计了除I. kodama外所有被研究Ivalia在台湾的多样化。随后，I. nakanoi和I. kodama的共同祖先从台湾殖民了八重山群岛，而I. variabilis则从八重山殖民了冲绳岛。因此，DIVALIKE+j情景揭示了塑造琉球群岛Ivalia分布的两个独立事件：从台湾的殖民和从古代亚洲大陆的隔离分化。

核基因渐渗检测

ABBA-BABA测试及随后的F-分支统计发现了Ivalia多样化历史中的几个基因渐渗事件。大多数渐渗事件发生在台湾物种之间，主要是在I. bella和I. uenoi物种复合群的各个谱系之间。最强的渐渗信号揭示在Ivalia bella和Ivalia sp. nov. 1之间（19.3%），以及在Ivalia sp. nov. 5和包含I. uenoi、I. sp. nov. 9和I. sp. nov. 10的支系的茎谱系之间（16.9%）。还发现了Ivalia bella与I. sp. nov. 3（6.5%）、I. sp. nov. 7（8.9%）、I. sp. nov. 8（13.2%）、I. sp. nov. 10（9.1%）和I. uenoi（9.3%）之间的几个次要渐渗事件。此外，还发现了I. sp. nov. 7和日本物种I. nakanoi之间（4.6%）的浅层渐渗迹象，这是唯一检测到的台湾和日本物种之间的渐渗。

群体遗传聚类

使用排除外群的SNP数据集进行STRUCTURE聚类分析，比较了将数据集从K=1到K=20分组的场景。Evanno DeltaK方法发现最佳K=2，在K=16和K=19处有次要峰值。Pritchard方法确定最佳K为19。不同的估计允许在不同尺度上洞察不同Ivalia物种之间的遗传结构。在K=2时，分析将数据集分为两个主要组：一个包含所有日本物种和I. bella，另一个代表I. uenoi物种复合群。几个物种，如Ivalia sp. nov. 1，产生了模糊的组分配。最强烈的模糊性（表明混合）在Ivalia sp. nov. 1和Ivalia bella中发现。对于高K=16和K=19，分析倾向于将数据集划分为研究人员发现的物种，但有一些例外和替代情景。日本物种以及I. bella在所有情况下都被确定为独立的。除I. bella外，该分析对仅由一个标本代表的物种分组存在困难。

讨论

台湾-琉球岛弧Ivalia的物种多样性和系统发育

为了评估台湾和日本Ivalia的物种多样性，研究人员使用通用后生动物cox1条形码引物LCO/HCO进行DNA条形码分析，并使用ddRAD测序进行核基因座组装。基于先前的研究，预计台湾动物区系由Ivalia bella和一个复杂的Ivalia uenoi物种复合群组成，并且琉球群岛的Ivalia物种根据其外部形态与台湾物种相关。基于条形码和ddRAD测序的结果证实了台湾和日本Ivalia之间的关系。研究人员还验证了四个已知Ivalia物种的物种身份：日本的I. kodama、I. nakanoi和I. variabilis，以及台湾的I. bella。此外，还鉴定了一个来自台湾的未知Ivalia物种（Ivalia sp. nov. 11），与已知物种谱系无关。在两个分析中，Ivalia uenoi物种复合群都形成了一个单系谱系。

将cox1系统发育与ddRAD系统发育进行比较揭示了强烈的有丝分裂核不一致性，这阻碍了基于cox1条形码数据正确界定物种。有丝分裂核不一致性在各种类群中都有记载。在昆虫中，这通常是由不完全谱系分选或线粒体渐渗驱动的，后者通常与Wolbachia感染有关。在典型由Wolbachia驱动的mtDNA渐渗案例中，多个物种共享相同或几乎相同的cox1单倍型，导致DNA条形码无法进行物种鉴定。然而，在本研究中，没有物种共享相同的单倍型。相反，它们的cox1序列高度相似，导致种间多样性与其他物种（如Ivalia nakanoi）的种内变异相当。这尤其可以在bPTP界定分析的结果中证明，该分析正确识别了I. uenoi复合群中的物种，但错误地将I. nakanoi的各种谱系划分为独立的物种。因此，研究人员假设结果表明了古老的线粒体渐渗事件，随后每个物种内单倍型独立进化。

研究人员确定了三个在分类学上具有误导性的单系cox1簇，表明在Ivalia uenoi物种复合群的多样化过程中至少发生了三次古老的线粒体渐渗。其中一个谱系由共存于大雪山地区的物种组成，表明这一特定的渐渗事件发生在那里。此外，Dsuite渐渗分析检测到I. bella和I. uenoi物种复合群之间强烈的核DNA渐渗信号。总之，这些发现表明，在I. uenoi物种复合群早期多样化过程中，渐渗是常见的。

Ivalia的多样化历史和生物地理学

研究结果显示了日本和台湾Ivalia物种分布模式的显著差异。在日本，物种广泛分布在相邻岛屿上。另一方面，在台湾发现的所有物种都非常局部性分布，表明台湾物种可能是微特有的。在台湾中部的大雪山地区，检测到三个远缘相关物种的同域共存，它们有线粒体渐渗的历史，但在线粒体和核水平上都没有近期混合的迹象。由于台湾的每个研究地点都产生了未在其他采样点发现的特定物种，研究人员认为Ivalia uenoi物种复合群内的总物种多样性在台湾可能更高。这些发现表明，进一步的野外工作有助于澄清台湾Ivalia的物种丰富度和进化模式的程度，从而有助于更好地理解台湾的生物多样性。

时间校准的系统发育分析估计，台湾和日本Ivalia之间最深的分化发生在新新世晚期。尽管台湾-琉球岛弧的地质历史仍然很大程度上不确定，但现有研究表明，抬升台湾山脉的蓬莱造山运动发生在大约1000万到500万年前，而琉球群岛的分离始于同一地质时期。研究结果表明，Ivalia的初始多样化与这些主要地质事件相吻合。

祖先生物地理分布范围制图表明，台湾-日本地区最早的Ivalia种群分布在台湾和奄美大岛，暗示了以下生物地理情景：基于冲绳海槽张开的最早估计，研究人员推断台湾-日本Ivalia的最晚共同祖先沿中新世晚期的亚洲太平洋海岸分布。在这个祖先物种内，至少有两个种群分开：沿海种群（= I. kodama的祖先）和台湾种群。随着上新世早期冲绳海槽的张开，沿海谱系幸存下来，随后在现在的奄美大岛和德之岛地理隔离。同时，原台湾谱系在台湾山区内多样化，其中一个谱系大约在上新世/更新世边界殖民了南部和中部琉球群岛。类似通过陆桥介导的向琉球群岛及其内部的扩散在更新世和上新世/更新世边界在蜥蜴属Takydromus以及哺乳动物中也有记载。

从台湾向琉球群岛的殖民可能由陆桥和洋流促进。或者，琉球岛弧生物区系的起源被归因于隔离分化。研究结果表明，琉球群岛的Ivalia多样性是通过两种过程的结合起源的：I. kodama在中新世晚期的隔离分化和I. variabilis和I. nakanoi在上新世-更新世从台湾通过陆桥扩散到冲绳和八重山。因此，Ivalia的进化历史代表了目前为琉球群岛记录的最复杂的生物地理情景之一。

群体混合和物种间基因流

虽然系统发育分析显示了Ivalia uenoi物种复合群中清晰的物种界限，但群体基因组学分析的结果显示了几种物种之间古代和近期基因流的迹象。I. bella和I. uenoi复合群之间的渐渗可以被认为是 mostly ancient，因为这些谱系之间的系统发育距离；研究人员假设最近的基因流会影响mtDNA和核DNA拓扑结构。据此，研究人员还假设STRUCTURE遗传聚类在Ivalia sp. nov. 1和I. sp. nov. 2中暗示的“混合”应主要由观察到的渐渗以及可能的不完全谱系分选来解释。然而，STRUCTURE分析的结果暗示了I. uenoi、I. sp. nov. 8和I. sp. nov. 10之间可能存在混合。虽然I. sp. nov. 8和10的mtDNA谱系非常接近，但不能明确排除混合的可能性。然而，基于核DNA基因座的系统发育聚类，以及两个物种采集点之间的距离，研究人员认为最近的基因流不太可能。更可能的是，研究人员假设I. sp. nov. 8（发现于都兰山，台湾海岸山脉的一部分）与台湾主要山脉（元峰、阿里山等）种群的密切关系可能是更新世向海岸山脉东向殖民的结果。