基于PANoptosis相关基因的卵巢癌免疫治疗反应与预后预测模型构建及机制研究

《HUMAN MUTATION》：Prediction of Immunotherapy Response and Prognostic Outcomes for Patients With Ovarian Cancer Using PANoptosis-Related Genes

本文推荐一篇关于卵巢癌（OC）预后与免疫治疗反应预测的创新研究。作者通过整合多组学数据，构建了基于PANoptosis相关基因（PRGs）的风险模型（PRG score），涵盖PIK3CG、CAMK2A等8个关键基因。该模型能有效区分高、低风险患者（p<0.0001），并揭示高风险组免疫细胞浸润低、TIDE评分高、免疫治疗反应差的特点。研究还通过体外实验验证了PIK3CG在OC细胞增殖、迁移和侵袭中的关键作用。这一模型为OC的精准治疗和免疫疗效评估提供了新工具。

　　

1. 引言

卵巢癌（OC）是女性生殖系统第三常见且致死率最高的恶性肿瘤，约70%的患者确诊时已发生转移，5年总体生存（OS）率仅30%。高级别浆液性OC占上皮性OC病例的70%，是最常见且致命的亚型。由于症状非特异性，多数患者发现时已处于晚期。目前标准治疗包括肿瘤减灭术和铂类化疗，但高达70%的患者最终复发。近年来，OC生存率改善有限，亟需探索新的治疗策略。

PANoptosis是一种新型程序性细胞死亡方式，协调焦亡（pyroptosis）、凋亡（apoptosis）和坏死性凋亡（necroptosis）的交互作用。研究表明，PANoptosis与多种系统性疾病（如神经退行性疾病、炎症和感染性疾病）的发生密切相关。基于公共数据库的生物信息学分析已筛选出与多种癌症（如胰腺癌、胃癌）免疫反应、生物学过程和OS相关的PANoptosis相关基因（PRGs），并构建了预测特征。然而，PANoptosis在OC中的作用尚未明确。

本研究通过计算分析公共数据库，鉴定与OC预后相关的PRGs，构建风险模型，评估其预测免疫治疗反应和生存的价值，为OC的临床管理提供新见解。

2. 方法

2.1. 数据获取

从GEO和TCGA数据库获取OC患者的基因表达谱和临床数据。TCGA-OC FPKM值经log2转换并转换为TPM（transcripts per kilobase million）。训练队列（TCGA-OC）包含373个样本，验证队列（GSE32062）包含260个样本。从MSigDB数据库下载5个相关通路的基因集（如KEGG_NECROPTOSIS、HALLMARK_APOPTOSIS），合并定义为PANoptosis基因集。

2.2. PANoptosis基因的特征与互作分析

使用“maftools”R包分析TCGA-OC体细胞突变数据，表征PANoptosis基因的突变模式。通过GeneMANIA和STRING数据库（置信度阈值0.7）构建蛋白质-蛋白质互作（PPI）网络，使用Cytoscape进行拓扑分析。

2.3. 风险模型的构建与验证

通过单变量Cox回归筛选与OC预后相关的PANoptosis基因，再利用LASSO Cox回归（R包“glmnet”）减少基因数量并防止过拟合。逐步回归分析确定关键基因，构建PRG评分（PRG score = Σβi × Expi）。根据中位风险评分将患者分为高风险组（zscore > 0）和低风险组（zscore < 0），使用“survminer”进行生存分析，“timeROC”进行时间依赖性ROC曲线分析。

2.4. 免疫检查点基因与PRGs的相关性

使用“GGPUBR”、“ggplot2”和“ggExtra”R包分析免疫检查点相关基因与8个PRGs的相关性，统计显著性设定为p < 0.05。

2.5. 免疫微环境与免疫治疗分析

应用CIBERSORT、MCP-counter和ssGSEA算法量化免疫细胞浸润。使用TIDE算法评估T细胞功能障碍和排除情况，TIDE评分高表示对免疫检查点抑制剂（ICIs）反应低。利用TCIA数据计算免疫表型评分（IPS），评估对PD-1和CTLA-4阻断疗法的潜在反应。

2.6. 通路分析

使用GSEA分析MSigDB数据库的HALLMARK通路基因集，通过ssGSEA计算的HALLMARK富集评分比较不同组别的通路活性。

2.7. 细胞培养与瞬时转染

人正常卵巢细胞系IOSE-80和OC细胞系SK-OV-3培养于RPMI 1640培养基（含10% FBS、青霉素和链霉素）。使用Lipofectamine 3000转染试剂将si-PIK3CG转染至细胞，qRT-PCR验证敲低效率。

2.8. qRT-PCR

使用RNAiso Plus提取总RNA，PrimeScript RT试剂盒合成cDNA，ChamQ SYBR qPCR Master Mix进行实时PCR，GAPDH作为内参，2^?ΔΔCt法计算基因表达。

2.9. CCK-8测定

将SK-OV-3细胞接种于96孔板，培养48小时后加入CCK-8溶液，孵育3小时，测量490 nm吸光度评估细胞活力。

2.10. 伤口愈合试验

在六孔板中创建人工伤口，48小时后评估细胞愈合情况。

2.11. Transwell实验

使用Transwell小室（8 μm孔径）评估细胞迁移。将细胞接种于上室，下室加入含10% FBS的培养基，孵育48小时后固定、染色，显微镜下计数迁移细胞。

2.12. 统计分析

使用R（3.6.0版）和GraphPad Prism（10.0.4版）进行数据分析和可视化。Wilcoxon秩和检验比较两组连续变量差异，Spearman法评估相关性，log-rank检验比较生存差异，单因素/双因素方差分析和非配对t检验处理实验数据，p < 0.05为显著。

3. 结果

3.1. OC中预后相关PANoptosis基因的突变与互作

从TCGA数据库提取486个与OC预后相关的基因，单变量Cox回归筛选出40个与PANoptosis相关的基因。体细胞突变分析显示，这些基因突变频率较低，仅在APC（4%）、IGF2R（3%）、STAT4（2%）等基因中检测到突变。GeneMANIA构建的互作网络表明这些基因主要与蛋白酶体核心复合物和抗原呈递相关生物活动有关。STRING数据库分析鉴定出22个基因（如CD38、PSMA8、NFKB1、STAT4、PIK3CG）参与焦亡、坏死性凋亡和凋亡的串扰。

3.2. PANoptosis相关预后特征的建立与验证

LASSO回归和交叉验证（最优λ值=0.0341）从22个候选PRGs中筛选出8个关键基因（PIK3CG、CAMK2A、CD38、NFKB1、PSMA4、PSMA8、PSMB1、STAT4）构建风险模型。高风险组患者OS较短（p < 0.0001）。模型预测1年、3年、5年生存的AUC分别为0.59、0.67、0.66、0.67和0.69。在GSE32062数据集验证中，低风险患者预后更好，1年、3年、5年AUC分别为0.70、0.69、0.60、0.56和0.60。

3.3. 预后特征与临床特征的关系

年龄与风险评分显著相关，高龄（>59岁）高风险患者预后更差。晚期（III+IV期）或高级别（G3+G4）的高风险患者OS较差（p < 0.0001），表明风险分组不受其他临床因素干扰。

3.4. 临床诺莫图的建立

单变量分析显示年龄和PRG评分是显著预测因子，多变量分析进一步确认其独立性。整合年龄和PRG评分的诺莫图可评估OC患者1年、3年、5年OS，预测与实际OS高度一致。决策曲线分析（DCA）显示诺莫图和PRG评分预测性能优于其他临床病理特征。

3.5. 风险亚组肿瘤微环境差异

CIBERSORT分析显示低风险组滤泡辅助T细胞、M1巨噬细胞、浆B细胞和CD8⁺ T细胞浸润更高，高风险组M2巨噬细胞浸润更高，表明免疫抑制性TME。ssGSEA显示高风险组中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和调节性T细胞浸润增加。PRG评分与癌症相关成纤维细胞、中性粒细胞和内皮细胞正相关，与细胞毒性评分、NK细胞和CD8⁺ T细胞负相关。PIK3CG、CD38、NFKB1和STAT4与免疫检查点基因正相关。

3.6. PANoptosis模型的基因组变化与富集通路特征

高风险组TIDE评分更高（p < 0.05），表明免疫逃逸潜力更大和治疗效果更差。低风险组对PD-1和CTLA-4阻断剂反应更活跃（IPS评分更高，p = 3.6e-10）。GSEA显示高风险组疾病进展相关通路（如HALLMARK_ANGIOGENESIS、HALLMARK_HEDGEHOG_SIGNALING、HALLMARK_EMT）显著激活。PRG评分与免疫相关通路（INTERFERON_ALPHA_RESPONSE、INTERFERON_GAMMA_RESPONSE）负相关，与UV_RESPONSE_DN和HEDGEHOG_SIGNALING正相关。体细胞突变分析检测到高风险组PRPF8突变率更高。

3.7. 关键基因的表达与功能验证

qPCR显示PIK3CG、CAMK2A、NFKB1、PSMA4和PSMB1在SK-OV-3细胞中显著高表达。si-PIK3CG#1敲低效率最高，显著抑制SK-OV-3细胞活力、迁移和侵袭（CCK-8、伤口愈合和Transwell实验）。

4. 讨论

OC是最致命的妇科恶性肿瘤之一，亟需新的预后生物标志物和治疗靶点。PANoptosis作为一种新型细胞死亡形式，在肿瘤调控中发挥关键作用。本研究首次基于8个PRGs（PIK3CG、CAMK2A、CD38、NFKB1、PSMA4、PSMA8、PSMB1、STAT4）构建了OC风险模型（PRG score），在TCGA和GEO数据集中均表现稳定。高风险组免疫细胞浸润低、免疫治疗反应差，表明PANoptosis特征与肿瘤免疫微环境密切相关。体外实验验证了基因表达及PIK3CG的促侵袭和增殖潜力。

这些基因与肿瘤发生、进展和治疗密切相关。例如，PIK3CG激活与非小细胞肺癌增殖相关，突变可能导致耐药性；CAMK2A低表达与胶质瘤良好预后相关，但也降低免疫治疗效果；CD38通过促进TME免疫浸润和抗肿瘤免疫改善OC预后；NFKB1是NF-κB通路关键组分，可被去甲肾上腺素调节促进OC发展；PSMA家族基因影响细胞增殖、泛素分解、氧化损伤和免疫信号；PSMB1通过促进蛋白酶体依赖性癌蛋白降解成为结直肠癌潜在生物标志物；STAT家族蛋白调控肿瘤进展和治疗抵抗。

肿瘤与免疫环境相互作用是ICI研究的热点。既往研究表明，PANoptosis影响免疫检查点基因表达、TME免疫细胞数量和免疫治疗反应。本研究评估了OC免疫浸润景观，发现低风险患者TME中M1巨噬细胞、CD8⁺ T细胞、浆B细胞和滤泡辅助T细胞浸润更高，这与更好OS一致。高风险组M2巨噬细胞丰度更高，与免疫抑制显著相关。

近年来，多种免疫治疗预测模型用于指导患者对ICI反应。本研究首次聚焦PANoptosis，构建了八基因PRG评分，为OC患者提供稳定有效的预后分层，与TIDE和IPS评分紧密相关，反映TME状态和潜在免疫治疗反应，表现出强泛化能力和临床适应性。然而，研究存在局限性：回顾性数据固有选择偏倚可能影响模型稳健性；除CD38、NFKB1和STAT4外，其余五基因在OC进展和肿瘤免疫微环境中的机制尚不清楚，需进一步通过体内外实验探讨。

5. 结论

本研究建立的PRG评分能准确识别高风险OC患者并预测预后，揭示了高低风险组与不同临床病理特征、免疫浸润、免疫反应和体细胞突变的相关性。首次提出PANoptosis在OC中的潜在价值，有助于预后和靶向治疗临床评估。