骨髓间充质干细胞来源的外泌体通过诱导上皮-间质转化促进结直肠癌干细胞恶性进展

《Stem Cells International》：Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells-Derived Exosomes Promote the Proliferation, Invasion, and Metastasis and Inhibit Apoptosis of Colorectal Cancer Stem Cells

本研究发现，大鼠骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）分泌的外泌体（Exosomes）能够被结直肠癌干细胞（CRC-CSCs）有效摄取，并通过诱导上皮-间质转化（EMT）过程，显著增强癌干细胞的增殖、迁移、侵袭能力，同时抑制其凋亡。体内实验进一步证实，这些外泌体促进了肿瘤的生长和肺转移。该研究揭示了肿瘤微环境（TME）中BM-MSCs通过外泌体介导细胞间通讯、驱动癌症进展的新机制，为靶向肿瘤微环境的治疗策略提供了新的思路。

　　

骨髓间充质干细胞来源的外泌体通过诱导上皮-间质转化促进结直肠癌干细胞恶性进展

引言

结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）是全球范围内发病率和死亡率均位居前列的恶性肿瘤。癌干细胞（Cancer Stem Cells, CSCs）被认为是肿瘤发生、发展、转移及治疗抵抗的关键细胞亚群。CSCs的功能和特性深受其所在肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）的调控。在TME中，间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs），特别是来源于骨髓的BM-MSCs，能够被招募至肿瘤部位，并积极参与调控肿瘤的生长和转移。既往研究表明，大鼠BM-MSCs能直接增强结直肠CSCs的侵袭和迁移能力，但其具体机制尚不明确。细胞外囊泡，尤其是外泌体（Exosomes），是TME中介导细胞间通讯的重要载体。BM-MSCs可分泌外泌体并影响受体细胞的行为。基于此，本研究提出假设：BM-MSCs对结直肠CSCs的促癌作用主要由其分泌的外泌体介导，并旨在评估大鼠BM-MSCs来源的外泌体对人结直肠CSCs增殖、凋亡、侵袭和转移的影响，同时探讨上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）是否为其潜在作用机制。

材料与方法

研究使用SPF级雄性SD大鼠（3-4周龄）分离BM-MSCs，并使用SPF级雄性BALB/c裸鼠（4-6周龄）进行体内实验。人结直肠癌HCT116细胞系培养后，通过无血清悬浮培养法富集获得HCT116-CSCs（第三代微球体用于实验）。采用差速离心结合商业化外泌体提取试剂盒从大鼠BM-MSCs条件培养基中分离外泌体，并通过透射电镜、纳米颗粒追踪分析和Western Blot（检测标志蛋白CD9、CD63）进行鉴定。使用PKH67荧光染料标记外泌体，并与HCT116-CSCs共培养，于荧光显微镜下观察其摄取情况。将HCT116-CSCs分为三组：对照组（无处理）、PBS组（等体积PBS处理）和Exo组（与200 μg BM-MSCs来源外泌体共培养）。通过CCK-8法、克隆形成实验检测细胞活力和增殖能力；流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期分布；Transwell小室实验（含或不含Matrigel基质胶）评估细胞迁移和侵袭能力。建立裸鼠皮下移植瘤模型，比较Exo组（注射经外泌体预处理的HCT116-CSCs）与对照组（注射PBS预处理的细胞）的成瘤能力、肿瘤体积/重量及肺转移情况。采用qPCR、Western Blot、免疫荧光和免疫组织化学法检测EMT相关标志物（E-cadherin, N-cadherin, Vimentin）在细胞和肿瘤组织中的表达。数据以均值±标准差表示，采用t检验或单因素方差分析进行统计学分析，p < 0.05认为有统计学意义。

结果

1. 1.
   BM-MSCs来源外泌体的鉴定与摄取：成功分离出典型杯状或球形、粒径主要在30-200 nm范围内的外泌体，高表达CD9和CD63。PKH67标记显示，外泌体可被HCT116-CSCs有效摄取，且摄取量呈时间依赖性增加（12, 24, 48小时）。
2. 2.
   外泌体促进HCT116-CSCs增殖：与对照组和PBS组相比，Exo组的HCT116-CSCs形态发生改变，CCK-8检测显示在48和72小时细胞活力显著增强，克隆形成实验也表明Exo组形成的克隆数显著增多。
3. 3.
   外泌体抑制HCT116-CSCs凋亡并改变细胞周期：流式细胞术结果显示，Exo组的早期凋亡率显著低于对照组，而晚期凋亡率无显著差异。细胞周期分析显示，Exo组G0/G1期细胞比例减少，S期细胞比例增加。
4. 4.
   外泌体增强HCT116-CSCs迁移和侵袭：Transwell实验表明，与对照组相比，Exo组穿过无基质胶膜的细胞数（迁移）和穿过基质胶膜的细胞数（侵袭）均显著增加。
5. 5.
   外泌体促进体内肿瘤发生和肺转移：体内实验显示，Exo组与对照组皮下成瘤率相同（3/5），但Exo组肿瘤体积增长更快，终点时肿瘤重量显著大于对照组。肺组织H&E染色显示Exo组肺转移结节数量显著多于对照组。肿瘤组织免疫组化显示Exo组Ki-67表达升高。
6. 6.
   外泌体通过诱导EMT发挥作用：在体外，免疫荧光、qPCR和Western Blot结果一致表明，与PBS组相比，Exo组HCT116-CSCs的E-cadherin（上皮标志）表达下调，而Vimentin和N-cadherin（间质标志）表达上调。在体内，移植瘤组织的免疫组化结果同样证实，Exo组肿瘤组织中E-cadherin表达降低，N-cadherin和Vimentin表达升高。

讨论

本研究证实，大鼠BM-MSCs来源的外泌体能够促进人结直肠CSCs的恶性表型，包括增强增殖、迁移、侵袭和转移能力，同时抑制凋亡，其机制与诱导EMT过程密切相关。CSCs的可塑性和侵袭性深受TME调控。BM-MSCs作为TME中的重要基质成分，可通过分泌因子与癌细胞相互作用。外泌体作为细胞间通讯的关键载体，在此过程中扮演了重要角色。本研究发现外泌体能够被CSCs摄取并诱导EMT，而EMT是驱动肿瘤细胞获得迁移、侵袭能力和干细胞样特性的关键过程。EMT与干细胞特性之间存在密切联系，形成自我强化的循环，促进肿瘤进展和治疗抵抗。本研究中观察到的细胞周期变化（G0/G1期减少，S期增加）也与EMT相关信号通路（如Wnt/β-catenin, PI3K/Akt）激活细胞增殖的效应一致。研究结果与肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）来源外泌体可增强癌细胞干性和诱导EMT的报道相呼应，进一步强调了TME中不同基质细胞来源的外泌体在调控肿瘤恶性进展中的普遍性和重要性。

局限性方面，本研究仅使用了一种CRC-CSCs模型（HCT116来源），未来需在其他细胞系或患者来源类器官中验证。跨物种模型（大鼠外泌体作用于人细胞）虽有助于机制探索，但需用人源BM-MSCs外泌体进一步验证临床相关性。外泌体中具体起作用的分子货物（如特定miRNA、蛋白质）尚未鉴定，需进行组学分析。此外，未设置非MSC来源的外泌体作为对照，是未来研究需要完善之处。

结论

本研究揭示了TME中BM-MSCs通过分泌外泌体诱导CSCs发生EMT，从而驱动结直肠癌进展的新机制。从转化医学角度看，靶向这一特定通路——例如抑制外泌体的生物发生、分泌、摄取，或中和其关键的致癌 cargo——可能成为一种有前景的治疗策略，用以破坏促肿瘤的细胞间对话。将此类靶向干预与常规化疗或免疫治疗相结合，或有助于抑制CSCs驱动的转移并克服治疗抵抗，最终改善晚期结直肠癌患者的临床结局。