酒精消费模式对免疫应答失衡的影响：从危险饮酒到酒精性肝炎的免疫细胞与细胞因子动态变化

《MEDIATORS OF INFLAMMATION》：Imbalance of the Immune Response According to Alcohol Consumption Patterns

本综述深入探讨了不同酒精消费模式（HD、l-AUD、ms-AUD、肝硬化及AH）对免疫系统的系统性影响，通过分析外周血淋巴细胞亚群（CD3+、CD4+、CD8+、NK、NKT）及细胞因子谱（IL-6、CXCL-8、TNF-α等）的变化，揭示了酒精摄入量与免疫失衡的剂量依赖性关系，为酒精使用障碍（AUD）和酒精相关肝病（AALD）的早期诊断提供了潜在生物标志物和治疗靶点。

　　

引言

酒精是全球范围内最被接受的成瘾性物质，其消费与健康、经济和社会问题密切相关。据估计，全球约有7500万人患有酒精使用障碍（AUD），显著增加发展为酒精相关肝病（AALD）的风险。AUD可诱导肝硬化和肝细胞癌，成为肝损伤的主要原因。酒精消费的社会协议因文化而异，但世界卫生组织（WHO）将中度至重度AUD（ms-AUD）定义为男性饮酒≥70克/天，女性≥50克/天，持续5年以上。然而，这些消费量并不总是被视为严重的健康问题。酒精消费涉及生物、遗传、文化、社会和心理因素，且“正常”或“过度”消费常带有个人模糊性和社会污名。AUD识别测试（AUDIT）和精神疾病诊断与统计手册（DSM）标准是检测饮酒模式的筛查工具，但它们未考虑生化和临床证据，可能导致诊断延迟，促进AALD或MetALD的进展。

酒精代谢始于十二指肠，促进黏膜溃疡和上皮侵蚀。酒精代谢物如乙醛可诱导DNA加合物，导致细胞损伤。这些病理变化改变肠道通透性和微生物群，促进内毒素（LPS）易位，经门静脉潜在诱导肝脏炎症和纤维化，激活Kupffer细胞和肝星状细胞。内毒素和酒精代谢在肝实质氧化应激和炎症中起关键作用。酒精对免疫应答的影响存在争议，但临床证据支持酒精滥用与感染性疾病易感性之间的关联。然而，免疫功能的特定变化尚未完全阐明，常被视为临床 insignificant。

材料与方法

这项横断面研究招募了1000名受试者，其中427名根据酒精消费标准分类，使用AUDIT测试和DSM-IV及V，考虑频率、数量、酒精质量和临床数据。危险饮酒（HD）定义为AUDIT>8且DSM-IV阴性，低AUD（l-AUD）为AUDIT>8且DSM-IV有2-3个阳性答案，中度至重度AUD（ms-AUD）为AUDIT>8且DSM-IV有4-5个以上阳性答案。ms-AUD分类还根据WHO酒精中毒分类（酒精消费≥70克/天男性，≥50克/天女性，持续5年）。肝硬化和酒精性肝炎（AH）的诊断包括临床和生化证据。对照组（CT）由353名血库捐赠者组成，AUDIT<8，偶尔酒精消费≤40克/次。排除标准包括HIV、甲型、乙型和丙型肝炎阳性血清学，系统性感染，自身免疫疾病，合并症（如糖尿病和高血压），其他并发肝损伤，创伤性脑损伤或中枢神经系统 disorders。

生化参数包括胆红素（总胆红素和直接胆红素）、白蛋白、葡萄糖、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）和γ-谷氨酰转移酶（GGT）。血液学数据包括总白细胞、淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。淋巴细胞亚群（CD3⁺、CD8⁺、CD4⁺、自然杀伤细胞[NK⁺]和NKT⁺细胞）通过FACS分析确定，而细胞因子水平使用多重阵列技术测定。进行了多重比较、Spearman相关性、计算比率和受试者操作特征（ROC）曲线。

结果

受试者分布与CT组

总共780名参与者符合纳入标准。CT组包括353名受试者，其中144名女性（年龄范围18-56岁）和209名男性（年龄范围18-61岁）。427名患者根据酒精消费模式选择（HD=80，l-AUD=42，ms-AUD=122，肝硬化=121，AH=62）。年龄调整显示肝硬化组与CT受试者之间存在统计学差异，由于慢性疾病的内在条件和捐赠者标准 employed。

AUDIT和酒精消费显示分数逐渐增加。AH组的AUDIT分数最高，达33分。每次场合和每天的酒精消费克数在酒精模式中持续升高，主要在ms-AUD、肝硬化和AH中，所有研究组均显示统计学差异。

生化变化

CT亚组根据BMI被分类为超重。酒精组内分析显示，l-AUD处于正常BMI范围，而HD、ms-AUD、肝硬化和AH超重。肝硬化和AH患者显示更高的总胆红素水平，比HD、l-AUD和ms-AUD高。直接胆红素浓度在肝硬化组处于正常范围，而AH患者直接胆红素浓度升高，反映肝脏失代偿。白蛋白水平在慢性AALD和AH中降低，可能与肝功能减少相关。此外，转氨酶（AST、ALT和GGT）在肝硬化和AH组中以消费依赖方式增加，在AH中达到最大值。葡萄糖水平在所有组中正常，但在肝硬化和AH患者中较高。

相关性分析显示，在HD组中，AUDIT和GGT呈中度正相关（0.336，p<0.01），而在ms-AUD中，总胆红素与AST（0.646，p<0.001）、ALT（0.444，p<0.01）和GGT（0.391，p<0.05）正相关；直接胆红素与AST（0.476，p<0.01）和GGT（0.380，p<0.05）正相关；ms-AUD显示白蛋白与AST（-0.556，p<0.001）、直接胆红素（-0.537，p<0.001）、总胆红素（-0.433，p<0.01）和GGT（-0.345，p<0.05）负相关。在肝硬化组中，AST与总胆红素和直接胆红素水平中度相关（0.532，p<0.001；0.579，p<0.001）。ALT与总胆红素水平也呈正相关（0.396，p<0.001）。相反，白蛋白水平与总胆红素（-0.507，p<0.001）、直接胆红素（-0.554，p<0.001）和AST（-0.457，p<0.001）负相关。

外周血细胞数量变化

AH组显示最高数量的白细胞，可能与系统性炎症反应和感染过程相关。HD versus AH（r=0.50；p<0.001）、ms-AUD versus AH（r=0.45；p<0.001）和肝硬化 versus AH（r=0.48；p<0.001）发现大效应量。中性粒细胞在AH组中显著增加，与ms-AUD（r=0.44；p<0.001）和肝硬化（r=0.55；p<0.001）组相比。肝硬化组的淋巴细胞数量较少，而单核细胞在酒精性肝硬化和AH中增加。嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞评估显示无统计学差异。

在l-AUD组中，淋巴细胞与单核细胞正相关（0.421，p<0.05）。在ms-AUD中，单核细胞与每次场合酒精克数（0.397，p<0.01）和中性粒细胞（0.312，p<0.01）正相关，白蛋白与单核细胞（-0.502，p<0.05）和白细胞（-0.380，p<0.05）负相关。在肝硬化中，白细胞与直接胆红素（0.440，p<0.001）、GGT（0.391，p<0.001）和总胆红素（0.388，p<0.001）中度相关。中性粒细胞与总胆红素和直接胆红素正相关（0.371，p<0.01；0.43，p<0.001），与GGT（0.361，p<0.01）也相关。单核细胞与中性粒细胞（0.536，p<0.001）和淋巴细胞（0.548，p<0.001）相关，中性粒细胞与淋巴细胞相关（0.452，p<0.001）。在AH中，白细胞和中性粒细胞计数显著相关（0.630，p<0.05）。中性粒细胞与AUDIT高度正相关（0.746，p<0.01），与GGT中度正相关（0.654，p<0.05）。单核细胞与酒精消费（克/天）（0.633，p<0.05）和每次场合酒精克数（0.633，p<0.05）相关。有趣的是，白细胞和中性粒细胞的相关性是HD（0.712，p<0.001）、l-AUD（0.899，p<0.001）、ms-AUD（0.891，p<0.001）、肝硬化（0.892，p<0.001）和AH（0.63，p<0.01）共享的唯一相关性。

淋巴细胞亚群改变

HD组显示CD4⁺淋巴细胞减少，与CT组相比（r=0.37；p<0.01），可能是酒精对免疫应答早期影响的结果。l-AUD和CT组之间观察到CD4⁺（r=0.18；p<0.01）和CD8⁺（r=0.12；p<0.05）计数差异。ms-AUD显示较少的淋巴细胞（CD3⁺，r=0.22；p<0.01）和CD4⁺淋巴细胞亚群（r=0.28；p<0.001），与CT组相比。淋巴细胞减少症（CD3⁺，r=0.44；p<0.01）在肝硬化 versus CT中明显，CD8⁺（r=0.53；p<0.01）和CD4⁺/CD8⁺比率（r=0.37；p<0.01） versus CT（p<0.001）。相反，CT组中CD4⁺细胞显著增加，与HD（r=0.37；p<0.01）、l-AUD（r=0.18；p<0.01）和ms-AUD组（r=0.28；p<0.01）相比，而CD8⁺亚集在肝硬化组中数量最低，与HD（r=0.10；p<0.01）、l-AUD（r=0.12；p<0.01）和ms-AUD组（r=0.05；p<0.01）相比。当分析CD4⁺/CD8⁺比率时，数据显示肝硬化患者中CD4⁺/CD8⁺比率显著增加，与HD（r=0.95；p<0.001）、l-AUD（r=0.35；p<0.001）和ms-AUD（r=0.56；p<0.001）相比，可能与纤维化晚期阶段相关。AH显示最高百分比的CD4⁺，与l-AUD（CD4⁺ r=0.18；p<0.01）和ms-AUD（CD4⁺ r=0.18；p<0.01）组相比。然而，AH中CD8⁺淋巴细胞百分比显著增加，与肝硬化相比（r=0.15；p<0.05），可能由于酒精的急性效应。此外，AH中CD4⁺/CD8⁺比率显著高于HD（r=0.16；p<0.05）和ms-AUD（r=0.14；p<0.01）组。

关于NK细胞，ms-AUD比CT组水平更高，以及最高水平的NKT细胞（r=0.23；p<0.001和r=0.21；p<0.01）。肝硬化也呈现NK细胞比例增加，与CT组（r=0.28；p<0.001）、HD（r=0.45；p<0.05）和AH（r=0.25；p<0.001）相比。相反，肝硬化中NKT细胞水平减少，与ms-AUD相比（r=0.26；p<0.05）。AH显示NK细胞和NKT细胞明显减少，与所有评估组（酒精消费和CT组）相比，ms-AUD（r=0.20；p<0.001）和肝硬化（r=0.25；p<0.001）比较中Cohen值适中。总之，淋巴细胞CD3⁺水平调节如下：AH=l-AUD >HD >ms-AUD >肝硬化。CD4⁺增量是AH >肝硬化 >ms-AUD >l-AUD >HD，而CD8⁺是ms-AUD >HD >AH=l-AUD >肝硬化。CD4⁺/CD8⁺比率是AH=肝硬化 >l-AUD >HD >ms-AUD；NK细胞是ms-AUD >肝硬化 >l-AUD >AH；NKT细胞是ms-AUD >l-AUD >HD=肝硬化 >AH。

细胞因子产生失调

HD组显示IL-4、IL-6和CXCL-8水平变化，与CT亚组组合平均值相比。l-AUD组显示IL-2、CXCL-8和TNF-α上调 versus其CT亚组。ms-AUD、肝硬化和AH组在所有评估细胞因子中显示显著差异，以及计算的效果大小（Cohen值确定）。ms-AUD组中IL-2、IL-4、IL-6、CXCL-8和TNF-α浓度高于l-AUD组。肝硬化与ms-AUD之间的组内差异显示IL-6（r=0.30；p<0.001）和CXCL-8（r=0.42；p<0.001）浓度更高。AH中IL-2、IL-4、CXCL-8和TNF-α血清浓度高于肝硬化（p<0.001）。AH中IL-10浓度最高。肝硬化和ms-AUD显示IL-10水平显著增加，与CT组相比（r=0.27；p<0.01，r=0.78；p<0.001）。IL-6、CXCL-8/IL-8和TNF-α水平根据酒精消费模式和肝损伤增加：ms-AUD、肝硬化和AH。

PCA显示PC1和PC2解释了细胞因子浓度总方差的76.5%（95%置信区间[CI]），PC1占58.5%，PC2占18.0%（95% CI）。PC1主要与促炎细胞因子相关，包括IL-6、CXCL-8、IL-10和IL-2，表明该成分捕获了整体炎症反应梯度。相反，PC2 largely受IL-4和TNF-α影响， suggesting an axis of variation related to immune regulation or Th2-like responses。细胞因子向量的方向和长度反映了它们对每个成分捕获的变异性的相对贡献。

考虑IL-6具有抗炎作用， resulting in the CXCL-8/IL-6, CXCL-8/IL-10, TNF-α/IL-6, and TNF-α/IL-10 ratios。CXCL-8/IL-6比率显示根据AUD状态逐步增加。重要的是，在该比率中，CXCL-8在HD中增加两倍多，在l-AUD中接近五倍，在ms-AUD中约六倍；在肝硬化患者中，差异为10倍，在AH中为20倍。计算比率根据消费模式和AALD之间的差异增加。这意味着 distant patterns (AH vs HD)的比较显示计算比率（CXCL8/IL-6=6.74）的更大差异；相反， closer patterns such as l-AUD versus HD的比较显示计算比率的差异较少（CXCL8/IL-6=1.64）。CXCL8/IL-10显示类似性能，其中CXCL-8根据AUD逐步增加。组间比较显示CXCL-8 over IL-10明显增加，当参考组为AH（44 times）时，最大价值比率在AH versus HD中观察到（19.74 times of CXCL-8 over IL-10）。

TNF-α/IL-6和TNF-α/IL-10比率显示TNF-α在肝硬化中比IL-6和IL-10高约12和25倍。然而，HD、l-AUD和ms-AUD中的TNF-α/IL-6和TNF-α/IL-10比率显示TNF-α仅增加约一个数量级与分析的细胞因子相关。有趣的是，在AH中，比率也显示TNF-α over IL-10 modest twofold increase。同样，对比比率显示肝硬化中TNF-α、IL-6和IL-10高度升高。

免疫细胞和细胞因子作为酒精消费模式的鉴别器

CXCL-8是酒精消费早期阶段的唯一鉴别因素，显示AUC为0.76（95% CI [0.56–0.95]，p<0.013）。l-AUD versus HD的 cutoff point为0.8 pg/mL，具有73.3（95% CI; 48–89.1）灵敏度和70.6（95% CI; 56.6–87.3）特异性。其他消费比较显示其他鉴别器的添加；例如，l-AUD versus ms-AUD、IL-6、CXCL-8和TNF-α存在显著差异。类似地，在ms-AUD versus肝硬化中，CXCL-8和IL-6是可溶性鉴别器。然而，在肝硬化 versus AH中，可溶性介质CXCL-8、IL-6、IL-10和TNF-α显示良好的AUC。其他消费模式 versus HD的比较显示更多鉴别器的逐步添加。例如，在AH versus HD中，中性粒细胞、IL-6、CXL-8、IL-10和TNF-α值高于90在AUC中，具有p<0.0001和95% CI在0.87–0.99的封闭区间中。此外，与比较组相关的重要因素总结在表中，允许根据酒精摄入区分变化水平。然而，根据AUD和肝病的严重性总结分析是：（HD?l-AUD?ms-AUD?肝硬化?AH）并在图中可视化，其中AUC值用于区分代表性元素或鉴别器（免疫细胞和细胞因子）的增加或减少。

讨论

适度酒精消费被认为有益，但 recent controversial evidence strongly suggests that, under certain circumstances, the beneficial properties are doubtful, even at low concentrations。在此背景下，过去几年 several efforts have been made to create a definition of a standard drink, because the recommended doses are usually not included on beverage labels。不幸的是，公众在购买和消费酒精饮料时误解或不熟悉这些考虑。

重要的是要注意，DSM-V目前用于评估酒精消费。然而，在本研究中，我们使用了DSM-IV和DSM-V，由于研究人群招募的时间。尽管如此，AUD的标准统一为低、中度和重度亚分类， without affecting the changes observed in the immune response reported herein。

AUD的早期阶段（HD和l-AUD）通常通过常规酒精测试（AUDIT、DSM和CAGE）评估。在酒精依赖或ms-AUD受试者中，最敏感的实验室测试包括GGT、平均 corpuscular volume和ALT/AST比率，但AUDIT和CAGE问卷被认为是最佳筛查工具。重要的是强调，AUD的早期阶段在制定策略预防其进展中至关重要。不幸的是， without intervention, AUD progresses to AALD, given that there are no approved biomarkers for AUD。在这个意义上，我们的数据显示AUDIT分数、酒精消费克数或酒精消费频率在HD和l-AUD组中没有变化。事实上，它们在所有评估参数中显示相似模式。因此，可能HD组中的 several subjects did not provide accurate information and may have belonged to the l-AUD group。这种密切关系 underscore the need to develop novel biological and biochemical markers, instead of relying on tools that depend on subjective self-reporting and memory。

另一方面，在我们的研究中，胆红素、白蛋白、葡萄糖、AST、ALT和GGT的值显示主要在l-AUD/ms-AUD、ms-AUD/肝硬化和AH之间的过渡中 overproduction，与先前报告的数据相关。使用Spearman等级相关性，我们的研究结果显示，在ms-AUD组中，总胆红素与AST、ALT和GGT正相关，而白蛋白显示负相关。在肝硬化组中观察到类似结果，如先前报告，表明这些参数可用作AALD进行性肝损伤的指标。

此外，急性和慢性酒精消费的直接和间接影响， resulting in hematological adverse events, have been previously reported。直接后果包括对骨髓、血细胞前体和红细胞的毒性。酒精滥用也被报告引起骨髓抑制和减少所有血细胞类型。2017年，根据酒精消费水平报告了白细胞数量的变化。我们的发现与这些变化相关，主要在肝硬化患者中，淋巴细胞总数减少，这与营养缺陷相关。相反，我们观察到AH患者中总白细胞和中性粒细胞数量过多。这种失调可能由乙醛和ROS overproduction形成的加合物产生。

人类中性粒细胞的酒精影响尚未完全理解。然而，肝脏中多形核中性粒细胞（PMNs）的存在被认为损害肝细胞存活。我们想强调，我们的发现显示循环中性粒细胞增加主要在AH患者中，这与 recent studies demonstrating that AH, compared with alcohol-associated cirrhosis, is characterized by the expansion of a self-sustaining population of IL-8⁺ neutrophils一致。在同一研究中，作者进行了单细胞RNA-Seq和免疫染色分析，显示AH中高达70%的肝脏非 parenchymal cells是IL-8⁺中性粒细胞，而此群体在肝硬化中 practically absent。

这些IL-8⁺中性粒细胞不仅对IL-8响应，而且自身产生IL-8， establishing a feed-forward loop that perpetuates neutrophil recruitment and activation。机制上，IL-8⁺中性粒细胞显示TNF-α和IL-1受体高表达和p38 MAPK pathway激活，进一步放大肝脏内的炎症反应。系统性循环中中性粒细胞的存在可能由于它们招募到肝脏或这些细胞谱系入侵以消除外周水平的加合物。此外，乙醇通过微生物 dysbiosis和肠道屏障完整性丧失促进肠-肝轴改变，进而诱导严重炎症反应，这是AH进展的核心特征。事实上，细菌易位被认为是慢加急性肝衰竭中系统性炎症的重要致病驱动因素。在这些事件中，PAMPs（例如LPS）和DAMPs（例如细胞损伤和死亡中的线粒体DNA）都可以在门静脉循环中旅行，促进肝内中性粒细胞浸润。此外，高肝内中性粒细胞和低水平CD8⁺ T细胞是AH的 clearly distinguished subtypes。此外，严重AH患者 demonstrated a high systemic neutrophil-to-lymphocyte ratio, which has been shown to be predictive of poor clinical outcomes。重要的是，己酮可可碱和泼尼松龙用于AH治疗。泼尼松龙是一种糖皮质激素（GC）， known to exert negative effects on T lymphocytes and to act as a nonspecific phosphodiesterase inhibitor, showing inhibition of TNF production in in vivo and in vitro studies。此外，GCs被认为是严重AH的标准护理，但现在有矛盾证据 regarding the effect of GCs on neutrophil functions。在特定条件下，GCs的使用促进抗炎或促炎作用，或甚至促进或抑制中性粒细胞凋亡。Ronchetti等人 suggested that these differential effects most likely depend on the underlying disease and the immunological microenvironment。此外，一些AH患者对泼尼松龙反应不积极，而其他患者不是GCs治疗的候选人。因此，靶向IL-8⁺中性粒细胞和 chemokine CXCL-8 represents a promising but untested therapeutic avenue in AH that merits further preclinical and clinical investigation, with careful attention to patient safety and infection risk。

此外，淋巴细胞亚群的 refined analysis显示酒精对CD4⁺、CD8⁺、NK和NKT细胞的早期影响。有趣的是，酒精促进CD4⁺细胞增加 in an alcohol-dependent manner (l-AUD <肝硬化><>⁺，它是肝硬化 <>⁺ T细胞被报告在AH患者中具有受损的细胞毒功能和减少的激活， contributing to susceptibility to infection。此外，我们观察到ms-AUD显示更高数量的NK细胞和NKT细胞，但生物学含义和细胞状态需要评估，包括它们的激活和效应能力。在慢性酒精性肝病（肝硬化和AH）中，外周NK细胞的减少和它们功能的抑制已被先前报告。此外，在AH患者中，NK细胞的激活和 degranulation capacity减少被报告。在此，我们提供宝贵证据，CD4⁺/CD8⁺比率、NK细胞和NKT细胞可用作AUD和AALD中免疫改变的指标，这在临床 context中有帮助。

酒精消费改变免疫介质，包括细胞因子， resulting in changes in the plasma, liver, lung, and brain levels。然而，IL-2在慢性肝病中的作用仍不清楚。在AALD慢性期，该细胞因子的较低血清活性在体外研究中被报告，但关于患者IL-2水平的信息有限， with respect to alcohol consumption。在肝硬化患者中观察到更高水平的IL-2，与我们的发现相关。那些作者报告IL-2在滤泡T辅助细胞激活中起关键作用。

类似地，我们在AH患者血清中发现IL-4产生升高。相反，在体外研究中，用乙醇（150 mg）处理B细胞导致IL-4产生减少。IL-2和IL-4的变化被认为与 recurrent gastrointestinal infection susceptibility相关。TNF-α、IL-1 α、IL-1β、IL-6、CXCL-8、IL-12和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的循环浓度被认为是诊断l-AUD的有希望的候选者。我们的关于IL-6、CXCL-8和TNF-α失调的数据与AALD的其他研究相关。我们还证明了这些细胞因子水平在有害酒精消费和AALD后增加。

此外，在我们的分析中，PCA分布和组的分离表明健康CT倾向于聚集向较低PC1分数，反映低炎症基线，而临床组（例如l-AUD、ms-AUD、肝硬化和AH）沿较高PC1值分布，指示 elevated systemic inflammation。这种分离 reinforces the biological relevance of the cytokine profiles and supports their