龟源寡肽通过双重调节疗效与血液毒性增强环磷酰胺抗肿瘤活性的多模态机制研究

《Food Science & Nutrition》：Tortoise Oligopeptides Augment Cyclophosphamide's Antitumor Activity Through Dual Modulation of Therapeutic Efficacy and Hematologic Toxicity

本研究首次系统阐释了龟源寡肽（TOPs）在环磷酰胺（CTX）化疗中的双重调节作用：通过调节肠道微生物群（如Colidextribacter、Tyzzerella等）改善CTX诱导的白细胞减少症（leukopenia），同时通过特异性活性肽（PAIPAPPVGPGPK、FSFPTLPF等）与关键肿瘤靶点（BCL-2/MDM2/EGFR）的高亲和力结合增强抗肿瘤疗效。TOPs不仅逆转了CTX引起的脾脏/股骨病理损伤和血清细胞因子（IL-4/IL-1β/TNF-α/IFN-γ）水平下降，还通过粪便微生物移植（FMT）实验证实了肠道微生物群在骨髓保护中的因果作用。本研究为开发兼具减毒增效功能的特医食品提供了新策略。

　　

1 引言

癌症是全球主要健康负担，环磷酰胺（CTX）作为一线化疗药物其临床应用常因严重白细胞减少症而受限。当前重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）存在潜在促肿瘤风险，亟需开发兼具骨髓保护与免疫支持功能的辅助策略。龟肉在传统医学中具有"补肾填精"功效，与现代医学中骨髓造血功能密切相关。本研究基于三种食用龟（Cuora trifasciata、Mauremys mutica、Chinemys reevesii）制备龟源寡肽（TOPs），系统评估其通过多模态机制调节CTX化疗毒副作用的潜力。

2 实验设计

2.1 TOPs制备与表征

采用1:1:1比例混合龟肉经胰蛋白酶水解、陶瓷膜过滤、喷雾干燥获得TOPs。营养分析显示其蛋白质含量达28.9 g/100 g，氨基酸组成以甘氨酸（16.2 g/100 g）、谷氨酸和脯氨酸为主。LC-MS/MS鉴定出12561种小分子肽，分子量主要≤5 kDa，肽段长度4-15个氨基酸。

2.2 生物信息学预测

通过TriNet神经网络筛选出678种具有抗肿瘤潜力的生物活性肽（占比6.56%）。分子对接显示PAIPAPPVGPGPK、FSFPTLPF和PGLPFHP与BCL-2（PDB:2O2F）、MDM2（PDB:1RV1）、EGFR（PDB:1M17）具有高结合亲和力（结合能<-100 kcal/mol），且强结合构象占比达30.5%-87.8%。

2.3 动物模型构建

建立CTX诱导的白细胞减少症小鼠模型（80 mg/kg腹腔注射×3天）和S180荷瘤小鼠模型。设正常对照组（NC）、模型对照组（MC）、低中高剂量TOPs组（LD/MD/HD: 0.12/0.24/0.48 g/mL）及荷瘤相应组别（TMC/TCTX/THD）。通过粪便微生物移植（FMT）实验验证肠道微生物群的因果作用。

3 结果

3.1 血液学保护效应

TOPs呈剂量依赖性逆转CTX导致的白细胞计数下降（HD组vs MC组，p<0.05），显著提升淋巴细胞百分比。同时恢复脾指数（SI）和胸腺指数（TI），改善脾脏白髓萎缩和股骨骨小梁结构破坏。血清ELISA检测显示TOPs上调IL-4、IL-1β、TNF-α和IFN-γ水平（p<0.05）。

3.2 抗肿瘤协同作用

在荷瘤模型中，CTX单用抑瘤率为71.7%，联合TOPs提升至78.94%。虽然最终肿瘤体积无统计学差异（THD:319.17 mm³ vs TCTX:428.83 mm³, p=0.442），但TOPs组因肿瘤过大处死率显著降低（χ²=4.747, p=0.093）。

3.3 肠道微生物群调节

16S rRNA测序显示TOPs恢复CTX引起的肠道菌群Shannon指数下降（p<0.05）。相关性分析发现Colidextribacter、Tyzzerella、Rikenella等菌属与白细胞计数呈正相关（r>0.6, p<0.01），而Eubacterium_siraeum_group、Lactobacillus等与肿瘤体积负相关。KEGG通路富集提示TOPs影响"免疫疾病"和"原发性免疫缺陷"相关通路。

3.4 机制分离验证

FMT实验证实：接受THD组菌群的受体（THD-R）白细胞计数和免疫器官指数显著改善（p<0.05），但肿瘤体积与TCTX-R组无差异。这表明肠道微生物群介导骨髓保护作用，而抗肿瘤效应由TOPs中直接作用肽段实现。

4 讨论

4.1 多层级免疫营养支持

TOPs通过三重机制缓解CTX毒性：①营养支持（高蛋白/必需氨基酸）；②免疫调节（细胞因子网络重建）；③器官保护（脾/骨髓结构修复）。这种多靶点作用优于单一机制药物。

4.2 双途径协同抗肿瘤

本研究首次通过FMT实验分离TOPs的双重机制：肠道微生物依赖的减毒作用与微生物非依赖的增效作用。特异性肽段如FSFPTLPF可同时靶向BCL-2（-112.1 kcal/mol）、MDM2（-115 kcal/mol）和EGFR（-124.4 kcal/mol），为多靶点抗肿瘤肽设计提供新模板。

4.3 临床转化潜力

TOPs作为传统药食同源物质的现代化开发范例，其1:1:1复配策略符合传统龟苓膏配伍规律，且能降低批次差异。未来需开展单物种肽谱比较研究及合成肽功能验证。

5 结论

龟源寡肽通过肠道微生物群调节和直接靶向肿瘤信号通路双重机制，实现环磷酰胺化疗的减毒增效。这种基于传统食疗智慧的多模态策略，为肿瘤辅助治疗提供了新型特医食品开发思路。