IFN-γ与TNF-α协同增强NK细胞对乳腺癌三维球体的浸润与杀伤作用及其机制研究

《Cell Death & Disease》：Combined IFN-γ and TNF-α treatment enhances the susceptibility of breast cancer cells and spheroids to Natural Killer cell-mediated killing

本研究针对乳腺癌（BC）特别是三阴性乳腺癌（TNBC）对自然杀伤（NK）细胞免疫疗法易感性低的问题，探讨了低剂量细胞因子IFN-γ和TNF-α的联合应用对NK细胞功能的调节作用。研究人员通过二维（2D）细胞培养和三维（3D）球体模型发现，该联合处理可上调BC细胞表面的死亡受体（FAS、TRAIL-R2）和黏附分子（ICAM-1），增强NK细胞与肿瘤细胞的结合、浸润及通过凋亡途径介导的杀伤效应，同时改变了浸润NK细胞的免疫表型。该研究为利用非毒性剂量的IFN-γ和TNF-α作为NK细胞免疫疗法的佐剂，提高BC治疗疗效提供了新的策略和实验依据。

　　

在癌症治疗领域，免疫疗法，特别是基于自然杀伤（Natural Killer, NK）细胞的疗法，展现出巨大的潜力。然而，实体瘤，尤其是像三阴性乳腺癌（Triple-Negative Breast Cancer, TNBC）这类侵袭性强的亚型，常常对免疫攻击产生抵抗。这种抵抗部分归因于肿瘤细胞自身的特性，也与其所处的复杂三维肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）密切相关。传统的二维细胞培养模型难以完全模拟体内的TME，而三维球体（Spheroid）模型能更好地再现肿瘤的结构和免疫抑制特性。因此，探索如何克服三维肿瘤结构对免疫细胞功能的抑制，是提高免疫疗法疗效的关键科学问题。

以往的研究表明，细胞因子如干扰素-γ（Interferon-gamma, IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-alpha, TNF-α）具有强大的免疫调节功能。然而，高剂量使用这些细胞因子常伴随严重的全身性毒性反应，限制了其临床应用。那么，是否可以使用低剂量、非毒性的IFN-γ和TNF-α来“重编程”肿瘤细胞，使其对NK细胞更加敏感，从而在不引起显著毒性的前提下增强免疫治疗效果呢？为了回答这个问题，研究人员在《Cell Death and Disease》上发表了他们的研究成果。

本研究综合利用了二维细胞培养和三维球体模型。关键实验技术包括：从健康供体外周血分离并体外扩增原代人NK细胞；建立乳腺癌细胞系（MCF-7, MDA-MB-231）的二维培养和三维球体模型；使用流式细胞术系统分析细胞表面分子（如NK细胞活化/抑制受体、肿瘤细胞配体、死亡受体等）的表达；通过共培养实验评估NK细胞的脱颗粒（CD107a表达）和诱导肿瘤细胞凋亡（Annexin V/7-AAD染色）的能力；采用荧光显微镜进行球体成像和NK细胞浸润分析；通过抗体中和实验验证特定分子（如FAS-L, TRAIL, LFA-1/ICAM-1）在功能中的作用；以及利用Caspase-Glo? 3/7检测法量化凋亡过程中的caspase活性。

Effect of IFN-γ+TNF-α-treatment on the expression of ligands for NKARs, death receptors and

研究人员首先在二维培养的乳腺癌细胞（MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-468）中评估了IFN-γ+TNF-α处理的影响。他们发现，这种处理并未显著上调大多数NK细胞活化受体（NKG2D, DNAM-1）的配体，但一致性地、显著地提高了死亡受体FAS和TRAIL-R2以及黏附分子ICAM-1的表达。这表明细胞因子的免疫调节作用可能主要通过凋亡通路和增强细胞间黏附来实现。

增强NK细胞介导的乳腺癌细胞凋亡

共培养实验证实，经IFN-γ+TNF-α处理的乳腺癌细胞对NK细胞诱导的凋亡更加敏感。使用广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK可逆转此效应，证明凋亡通路被激活。进一步的中和抗体实验表明，FAS-L、TRAIL和LFA-1/ICAM-1通路协同参与了NK细胞对处理后的MDA-MB-231细胞的杀伤作用。

增加NK细胞与乳腺癌细胞的结合

通过结合形成实验，研究人员发现IFN-γ+TNF-α处理显著增加了NK细胞与所有三种乳腺癌细胞系形成结合体的比例。使用抗ICAM-1和抗LFA-1抗体进行中和，可以显著降低这种增强的结合，证实了ICAM-1/LFA-1相互作用在此过程中的关键作用。

NK细胞浸润乳腺癌球体的能力增强

在三维球体模型中，MCF-7和MDA-MB-231能够形成球体，而MDA-MB-468不能。研究发现，IFN-γ+TNF-α处理显著促进了NK细胞向两种乳腺癌球体内部的浸润，荧光显微镜观察和流式细胞术分析均证实了这一点。

浸润与非浸润NK细胞的免疫表型

对球体内（浸润）和球体外（非浸润）的NK细胞进行免疫表型分析发现，浸润的NK细胞通常表现出更高的活化受体（如NKG2D, DNAM-1, NKp30, NKp46）表达水平，表明其处于更活跃的状态。然而，同时，浸润的NK细胞也高表达耗竭相关标志物如PD-1和CTLA-4，尤其是在TNBC模型MDA-MB-231的球体中更为明显，提示了在肿瘤微环境中激活与耗竭并存的状态。

IFN-γ+TNF-α处理对乳腺癌球体的免疫调节作用

在三维球体上评估配体表达，结果与二维模型类似。IFN-γ+TNF-α处理同样显著上调了MCF-7和MDA-MB-231球体细胞表面的TRAIL-R2、FAS和ICAM-1，而对大多数NKG2D和DNAM-1配体的表达影响不大甚至有所下调。这进一步支持了细胞因子主要通过调节死亡受体和黏附分子来发挥作用。

增加NK细胞介导的凋亡并减小球体尺寸

功能实验表明，IFN-γ+TNF-α处理本身能抑制球体生长，与NK细胞共孵育后，处理组的球体尺寸减小更显著。凋亡检测（Annexin V/7-AAD染色和Caspase 3/7活性检测）证实，NK细胞对处理后的球体诱导了更强的凋亡。有趣的是，尽管杀伤效果增强，但浸润到处理组球体内的NK细胞其脱颗粒水平（CD107a表达）反而低于浸润对照球体的NK细胞。这可能与处理组球体上MHC-I分子表达上调，对NK细胞活性产生抑制信号有关，暗示杀伤增强主要归因于凋亡通路的激活，而非颗粒酶/穿孔素途径。

本研究得出结论，低剂量、非毒性的IFN-γ和TNF-α联合处理，能够通过上调乳腺癌细胞（包括难治的TNBC模型）的死亡受体（FAS, TRAIL-R2）和黏附分子（ICAM-1），显著增强NK细胞介导的杀伤作用。在更接近体内情况的三维球体模型中，该处理促进了NK细胞的浸润，并增强了其通过凋亡途径清除肿瘤细胞的能力。尽管同时也观察到了NK细胞耗竭标志物的上调，特别是在TNBC模型中，但总体效应是积极的。这项研究的重要意义在于，它为将IFN-γ和TNF-α这两种经典的细胞因子以低剂量、联合用药的方式，作为NK细胞免疫疗法的佐剂提供了新的实验依据。这种方法有望克服实体瘤，尤其是TNBC的免疫抵抗，为提高乳腺癌免疫治疗的有效性提供了一种潜在的新策略。研究结果强调了肿瘤微环境在调节免疫细胞功能中的核心地位，以及根据肿瘤亚型特点进行个性化治疗组合的重要性。未来的研究需要进一步优化治疗方案，以平衡NK细胞的活化与耗竭，从而实现长期、有效的抗肿瘤免疫反应。