基于mCIM和PCR技术检测美罗培南耐药大肠杆菌中blaNDM-1和blaIMP-1金属β-内酰胺酶的流行特征及临床意义

《JOURNAL OF CLINICAL LABORATORY ANALYSIS》：Detection of blaNDM-1 and blaIMP-1 Metallo-β-Lactamases in Meropenem-Resistant Clinical Escherichia coli Isolates Using Modified Carbapenem Inactivation Method (mCIM) and PCR Techniques

本研究采用改良碳青霉烯酶灭活法（mCIM）和聚合酶链反应（PCR）技术，系统检测了伊朗西北地区临床分离的美罗培南耐药大肠杆菌中blaNDM-1和blaIMP-1金属β-内酰胺酶（MBL）的流行情况。结果显示46.25%的菌株为碳青霉烯酶阳性，其中blaNDM-1（48.65%）较blaIMP-1（16.22%）更为常见，10.81%的菌株同时携带两种基因。值得注意的是，35.14%的mCIM阳性菌株未检测到目标基因，提示存在其他耐药机制（如blaVIM或非酶机制）。该研究为碳青霉烯耐药菌的防控提供了重要地域流行病学数据。

　　

引言

大肠杆菌作为肠杆菌科的重要机会性病原体，是引起尿路感染、血流感染、手术部位感染和败血症等多种临床感染的主要病原。碳青霉烯类抗生素作为治疗多重耐药菌感染的最后防线，其有效性正受到产碳青霉烯酶大肠杆菌（CP-Ec）的严重挑战。其中，金属β-内酰胺酶（MBL）因其对锌离子的依赖性而具有独特的水解机制，能够灭活除单环酰胺类外的所有β-内酰胺类药物。bla_NDM-1和bla_IMP-1作为MBL的重要成员，其全球传播态势尤为严峻。本研究旨在通过表型检测和分子生物学方法，明确伊朗西北地区临床分离株中这两种耐药基因的流行特征。

材料与方法

研究共纳入80株临床分离的美罗培南耐药大肠杆菌，采样时间覆盖2024年5月至11月。菌株鉴定采用IMViC系列生化试验（吲哚、甲基红、VP试验和西蒙氏枸橼酸盐）结合尿素酶和三糖铁试验。通过Kirby-Bauer法确认美罗培南耐药性（抑菌圈直径≤19 mm）。

碳青霉烯酶表型检测采用改良碳青霉烯酶灭活法（mCIM）：将菌悬液与美罗培南纸片共孵育4小时后，贴敷于敏感指示菌（大肠杆菌ATCC 25922）平板，根据抑菌圈直径判读结果（6-15 mm或伴卫星菌落为阳性）。阳性对照为肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705，阴性对照为ATCC BAA-1706。

基因检测通过煮沸法提取DNA，采用自行设计的引物（参考序列：bla_NDM-1 OM937933.1，bla_IMP-1 MK088089.1）进行PCR扩增。反应体系为25 μL，循环条件包括95°C预变性4分钟，35个循环的94°C 30秒、65°C 30秒、72°C 50秒，最终72°C延伸10分钟。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳验证，目标条带大小分别为443 bp和430 bp。

结果

mCIM检测显示37株（46.25%）为碳青霉烯酶阳性。PCR基因分型发现：18株（48.65%）携带bla_NDM-1，6株（16.22%）携带bla_IMP-1，4株（10.81%）同时存在两种基因。值得注意的是，13株（35.14%）mCIM阳性菌株未检出目标基因，提示可能存在其他碳青霉烯酶基因（如bla_VIM）或非酶耐药机制（如外膜孔蛋白缺失或外排泵过表达）。电泳结果清晰显示特异性扩增条带，验证了方法的可靠性。

讨论

本研究揭示了伊朗西北地区碳青霉烯耐药大肠杆菌中MBL基因的复杂分布模式。bla_NDM-1的高流行（48.65%）与全球趋势一致，特别是在亚洲地区已形成区域性优势基因型。而10.81%菌株同时携带两种基因的现象，凸显了质粒介导的基因水平传播风险。值得关注的是，35.14%的表型阳性菌株未能通过PCR检出目标基因，这一方面可能源于本研究未覆盖的MBL变体（如bla_VIM或bla_SPM），另一方面也提示非碳青霉烯酶机制的重要作用，例如孔蛋白突变联合ESBLs产酶导致的碳青霉烯类抗生素渗透障碍。

与既往研究对比：印度报道bla_NDM-1在碳青霉烯酶阳性大肠杆菌中占比达61.7%，中国研究显示bla_NDM在耐药大肠杆菌中占96%，均高于本研究结果，反映地域流行差异。而乌干达研究发现bla_KPC（75%）为主要基因型，未检出bla_IMP，进一步说明基因分布的地理特异性。

方法学上，mCIM作为CLSI推荐的标准化方法，对MBL检测具有接近100%的敏感性和特异性，显著优于传统改良Hodge试验等方法。但本研究也表明，表型方法需结合分子检测才能实现精准分型，特别是在流行菌株存在未知耐药基因时。

结论与建议

bla_NDM-1和bla_IMP-1在伊朗西北部临床大肠杆菌中的流行证实了碳青霉烯耐药机制的多样化传播。建议后续研究拓展至其他MBL基因（如bla_VIM、bla_SPM）筛查，并结合全基因组测序（WGS）分析耐药基因的移动遗传元件背景。临床应建立基于mCIM与PCR的联合检测流程，为耐药菌感染防控和个体化治疗提供依据。