COX7C作为胃腺癌预后预测因子的生物信息学分析与实验验证

《BMC Gastroenterology》：Bioinformatics analysis and in vitro studies identify COX7C as a prognostic predictor in gastric adenocarcinoma

本研究针对胃腺癌(STAD)缺乏有效预后标志物的临床难题，通过整合生物信息学分析与体外实验，发现线粒体细胞色素c氧化酶亚基7C(COX7C)在STAD组织中显著低表达，并通过功能实验证实其过表达可抑制肿瘤细胞增殖、迁移并促进凋亡。该研究为STAD的分子机制提供了新见解，并为开发新的诊断和治疗策略提供了潜在靶点。

　　

在全球范围内，胃腺癌(STAD)仍然是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤，每年新增病例约95万例，死亡病例近70万例。尽管外科手术技术和化疗、靶向治疗等方面取得了进步，但晚期STAD患者的5年生存率在大多数国家仍低于30%。其中一个主要的临床挑战是缺乏稳健、特异且广泛适用的预后生物标志物，无法准确地对患者进行风险分层并指导个性化治疗。

随着基因组技术的进步，生物信息学在基因表达谱分析中的应用日益广泛，使研究人员能够在各种疾病中发现治疗靶点和生物标志物。然而，COX7C在STAD中的作用此前尚未被充分探索。这项研究旨在通过整合生物信息学分析和体外实验验证，发现与STAD临床相关的关键生物标志物。

研究人员利用GSE64951数据集筛选差异表达基因(DEGs)，并应用加权基因共表达网络分析(WGCNA)来识别与临床特征相关的关键基因模块。通过分子复合物检测(MCODE)分析从关键模块中提取出枢纽基因，并进一步进行生存分析和免疫浸润分析。在筛选出的基因中，细胞色素c氧化酶亚基7C(COX7C)因其显著的预后价值被选为后续研究的重点。研究人员通过qRT-PCR和Western blotting验证了COX7C在STAD组织和细胞系中的表达，并利用ROC曲线评估其诊断性能。此外，通过在MGC803细胞中进行COX7C的过表达和敲低实验，评估了其对细胞活力、凋亡、迁移和侵袭能力的影响。研究还利用了TCGA-STAD数据库进行生存分析和免疫评分分析，并构建了预后特征模型。

WGCNA分析筛选的DEGs

在GSE64951数据集（包含94个样本，其中63个STAD样本和31个正常样本）中，共识别出962个上调基因和451个下调基因。利用WGCNA算法为这些DEGs构建了共表达网络，最佳软阈值确定为22。基因被分类到三个模块中，其中蓝色和青绿色模块与临床样本的相关性最强（相关系数分别为0.406和0.405），因此被选为后续分析的关键模块。

关键共表达模块基因的功能富集分析

对蓝色和青绿色模块中的基因进行功能富集分析发现，这些基因显著富集于线粒体相关的生物过程，如“线粒体外膜通透化”、“调节线粒体膜通透性参与凋亡过程”和“线粒体自噬”。KEGG通路分析进一步支持了线粒体关联，显著富集的通路包括“线粒体自噬”和“氧化磷酸化”。此外，还发现了“泛素介导的蛋白水解”、“内吞作用”和“坏死性凋亡”等重要通路，表明COX7C共表达基因可能参与蛋白降解、细胞摄取和程序性细胞死亡过程。

STAD中关键模块基因的表达验证

将蓝色模块（112个基因）和青绿色模块（161个基因）的基因数据上传至STRING数据库构建了两个蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络。通过Cytoscape中的MCODE算法识别出子网络，蓝色模块子网络包含5个关键基因（COX7C、MRPS10、NSA2、RPS13和RPS25），青绿色模块子网络包含6个基因（GBP1、IFIT1、IFIT3、RSAD2、TNFSF10和TRIM22）。利用GSE64951数据集评估这11个基因在STAD中的表达水平，发现在肿瘤组织中普遍呈低表达。

STAD中11个基因的生存分析

通过KM生存曲线评估这些基因的表达水平与进展后生存期(PPS)和总生存期(OS)的关系。11个基因中有9个基因（IFIT1、IFIT3、RSAD2、COX7C、MRPS10、RPS25、NSA2、RPS13和TNFSF10）与改善的PPS概率显著相关（P<0.05）。这些基因的高表达与更好的OS结果显著相关，表明其高表达与STAD患者良好的预后相关。

上述9个基因与免疫细胞的免疫评分分析

使用EPIC算法评估并与9个关键基因相关的免疫评分，揭示了不同样本间不同的免疫细胞谱。例如，在COX7C组中，观察到CD4⁺T细胞、B细胞、NK细胞、内皮细胞和未表征细胞的显著免疫评分（P<0.05）。这些结果突出了与每个基因相关的多样化免疫微环境，为了解STAD患者的免疫状态提供了宝贵见解。

构建特征预后模型

根据基因表达水平将TCGA-STAD数据库中的STAD样本分为高风险组（n=174）和低风险组（n=175）。Cox回归分析确定了五个特征预后基因：TNFSF10、IFIT1、NSA2、RPS25和COX7C。风险分析显示，随着样本从低风险组向高风险组过渡，死亡率逐渐增加。KM生存曲线分析显示，两组的中位生存时间为3.6年，高风险组的疾病特异性生存(DSS)概率显著较低（HR=2.12）。ROC曲线分析进一步验证了模型的预测强度，1年生存率的预后准确性最高（AUC=0.672），其次是5年（AUC=0.639）和3年（AUC=0.624）生存概率。

COX7C是STAD预后中具有临床价值的枢纽基因

单变量和多变量Cox回归分析确定COX7C和性别，以及年龄、pT、pM和pTNM分期是TCGA-STAD数据库中STAD患者的关键临床预后因素（P<0.05）。构建了列线图以评估COX7C和性别对生存概率的影响（C-index=0.653，P<0.001）。线段分析表明，COX7C对生存结果的影响大于其他因素。校准曲线分析表明，1年生存预测与实际结果密切吻合，证实了模型对1年生存的强预测性能。最后，基因集富集分析(GSEA)确定了与COX7C相关的六个顶级富集通路，包括氧化磷酸化系统中的电子传递链、硒微量元素网络、氨基酸代谢、非酒精性脂肪肝病、Parkin泛素-蛋白酶体系统通路和VEGFA/VEGFR2信号通路。

COX7C在STAD组织中显著降低

通过RT-qPCR分析收集的29对人类STAD组织及其相应的癌旁正常组织，评估COX7C mRNA表达水平。与癌旁正常组织相比，29个STAD组织中COX7C表达显著降低（P<0.05）。通过ROC曲线分析进一步评估COX7C作为STAD生物标志物的诊断潜力，得出AUC值为0.7253（P<0.01）。蛋白质表达分析证实了这些观察结果，证明STAD组织中COX7C表达显著降低（P<0.05）。

COX7C在STAD细胞系中下调并在MGC803细胞中有效调控

对正常和STAD细胞系中COX7C表达的分析显示，与正常胃上皮细胞系GES-1相比，AGS、MGC803和HGC-27细胞中的mRNA和蛋白水平均降低（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。其中，MGC803在STAD细胞系中显示出最明显的COX7C抑制，因此被选为后续功能实验。为了评估过表达效率，在MGC803细胞中过表达了COX7C。定量分析证实，与未处理组和空载体对照组相比，COX7C过表达组(COX7C OE)中的COX7C mRNA和蛋白水平显著增加（P<0.0001）。为了抑制COX7C的表达，将三个独立的siRNA构建体（COX7C KD-1、KD-2和KD-3）导入MGC803细胞。其中，与非靶向对照组和未处理细胞相比，COX7C KD-1在转录和蛋白水平上显著降低了COX7C的表达（P<0.01）。

COX7C调节MGC803细胞的活力、凋亡、迁移和侵袭能力

COX7C的过表达导致细胞活力相较于对照组显著降低，而COX7C敲低则导致细胞活力相较于对照组显著增加（P<0.01）。同样，COX7C过表达显著促进细胞凋亡，而COX7C敲低则显著抑制凋亡（P<0.01）。在迁移实验中，COX7C过表达显著损害细胞迁移能力，而COX7C敲低则显著增强迁移（P<0.01）。在侵袭实验中也观察到类似的趋势，COX7C过表达显著抑制细胞侵袭，而其敲低则显著增强侵袭（P<0.01）。这些结果共同凸显了COX7C在调节STAD细胞活力、凋亡、迁移和侵袭中的关键调控作用。

这项研究通过综合生物信息学分析和体外实验验证，确立了COX7C作为STAD中一个重要的肿瘤抑制因子和潜在的预后生物标志物。研究发现COX7C在STAD组织和细胞系中表达显著下调，其低表达与患者不良预后相关。功能实验证明COX7C通过抑制细胞增殖、迁移和侵袭，并促进细胞凋亡，在STAD进展中发挥关键作用。基因集富集分析揭示了COX7C可能通过影响氨基酸代谢、非酒精性脂肪肝病相关通路以及VEGFA/VEGFR2信号通路等参与STAD的发病机制。

尽管存在一些局限性，如生物信息学分析仅限于DEGs可能引入偏差，预后特征的开发和验证使用单一回顾性队列数据限制了研究结果的普适性，以及实验验证仅限于单一STAD细胞系等，但这项研究为理解STAD的分子机制提供了新的见解，并表明COX7C可能作为改善诊断和治疗策略的一个有前景的靶点。这些发现为未来开发针对STAD的新型治疗策略奠定了基础，具有重要的临床转化潜力。