综述：生物治疗产品分析表征的快速高效液相色谱方法

《Journal of Chromatography Open》：Rapid High Performance Liquid Chromatography methodologies for analytical characterization of biotherapeutic products

本综述系统梳理了2019-2025年间快速高效液相色谱（HPLC）技术在单克隆抗体（mAbs）、抗体偶联药物（ADCs）等生物治疗蛋白分析中的最新进展。文章重点探讨了色谱设备（如UHPLC）、色谱柱创新（如核壳颗粒、整体柱）及先进方法学（如PAT整合、数据分析驱动）如何协同推动分析时间从数小时缩短至分钟级，同时保持分辨率与灵敏度，为生物制药连续工艺开发和实时质量属性（CQAs）监控提供了关键技术支撑。

　　

引言

过去四十年间，生物治疗药物彻底改变了医疗保健格局，成为制药管线中不可或缺的一部分，为难治性疾病提供了有效的治疗方案。然而，这类产品，尤其是复杂的单克隆抗体（mAbs），具有大量的关键质量属性（CQAs），必须在商业化产品开发过程中进行仔细表征。因此，在整个产品生命周期中，对用于识别、表征和监测单抗CQAs的高精度、高灵敏度分析方法的需求日益增长。

在表征复杂生物治疗产品时，通常使用一系列高分辨率、正交的分析方法，但液相色谱（LC）由于其相对于其他分析方法无与伦比的优势，仍然是分析表征的基石。与傅里叶变换红外光谱（FTIR）和荧光光谱（FLR）等光谱工具不同，液相色谱与不同类型的检测器（如UV和FLR）联用，因其无与伦比的特异性而更具优势，能够以高分辨率、高灵敏度和高重现性准确定量复杂化合物。这些优势使高效液相色谱（HPLC）成为表征重组生物治疗蛋白和疫苗的普遍工具，最近更扩展到疫苗、纳米抗体、抗体偶联药物（ADCs）和双特异性抗体（BiAbs）等新形态药物。

尽管HPLC非常流行，但传统的HPLC方法开发需要手动、逐步调整各种因素（如流动相、pH、温度、色谱柱类型），这非常耗时。标准HPLC系统的有限耐压性也限制了小粒径色谱柱的使用，影响了可达到的分辨率和速度。在许多情况下，样品制备和进样过程未实现自动化，这进一步降低了工作流程的速度，并可能引入人为错误。最后，传统的HPLC分析时间较长，典型的HPLC方法运行时间为30-60分钟，不适合实时分析或在线监测工具，而随着生物制造商希望实施连续制造或过程分析技术（PAT）应用，对实时分析的需求日益增长。

传统HPLC的这些局限性推动了对快速HPLC的兴趣，旨在显著缩短分析时间，同时不牺牲传统HPLC的稳健性、分辨率和灵敏度。这些方法有助于实现CQAs的实时、自动化和高通量分析及监测。在线或线上设置消除了手动取样和离线分析的需要，显著减少了分析时间、人为操作错误和污染风险。当在线分析与使用短柱、快速梯度和高流速的快速HPLC方法相结合时，循环时间急剧缩短，分析可以在几分钟而不是几小时内完成。

快速HPLC方法已广泛应用于工艺和产品开发的各个阶段，在这些阶段，分析时间至关重要。在工艺开发过程中，快速HPLC方法有助于实时监测CQAs，这对于放行检验、稳定性研究和过程控制非常理想。此外，快速HPLC方法已广泛用于表征生物治疗蛋白、单抗及其衍生物，包括纯度评估、聚集、电荷变体、糖基化谱和片段化。在制剂开发中，利用快速HPLC评估辅料相容性、降解途径和应激测试谱也提高了效率。

为了使HPLC方法更快，存在多种途径，包括使用填充有小粒径或表面多孔颗粒的短柱、提高流速、升高柱温以及优化梯度。此外，最大限度地减少样品制备步骤并结合自动化工具（如自动进样器或方法开发软件）可以进一步简化工作流程。先进的系统还可以采用柱切换技术或并行分析来提高通量。

快速HPLC方法在生物制药分析中的应用

HPLC方法学的进展

快速HPLC方法可以通过在分析方法开发过程中优化几个操作参数来实现。缓冲液、流速和方法梯度的优化是近年来广泛研究的例子。

缓冲液影响流动相的pH值、离子强度和整体选择性，这对于维持分析物稳定性、提高分辨率和控制保留行为至关重要。缓冲液的选择影响系统兼容性和色谱柱寿命，尤其是在高流速和陡梯度条件下。在快速HPLC方法开发过程中，缓冲液需要能够实现快速有效的分离，同时不牺牲峰形或重现性。

另一方面，高流速可缩短保留时间，从而实现更快的分析和更高的样品通量。然而，较高的流速可能会影响分辨率，导致峰展宽、分离效率降低、系统反压增加，并可能导致化合物共洗脱。因此，优化流速是一个重要的考虑因素。更陡的梯度通常可以缩短分析时间并提高通量。这使得它们在分辨率不如速度重要的早期筛选或常规测试中非常理想。然而，它们可能会影响分离质量，并可能导致密切相关的物质共洗脱。相比之下，浅梯度提高了分辨率和峰容量，这对于分析复杂样品和表征CQAs至关重要，但它们需要更长的运行时间。因此，需要在陡梯度和平缓梯度之间取得最佳平衡。

一些已发表的研究侧重于改进HPLC参数以创建更快的方法。例如，最近的一篇文章表明，在HPLC分析中使用S形梯度是一种强大的策略，可以显著缩短运行时间，并对像单抗和重组蛋白这样的复杂分子实现高分辨率分离。该研究使用反相色谱（RPC）分离粒细胞集落刺激因子（G-CSF）的产品相关变体。G-CSF的分析时间从70分钟减少到约15分钟，单抗的分析时间从40分钟减少到仅4分钟。这是通过仔细控制梯度斜率因子（通常对于蛋白质在2.0到2.5之间）来实现的。与传统的线性梯度（流动相组成以恒定速率增加）不同，S形梯度具有S形轮廓。它开始时斜率平缓，中间部分陡峭，最后逐渐趋于平缓。酸性变体、主峰和碱性变体都得到了很好的分离，关键峰之间的分辨率目标大于1.2和2.5。

仔细的缓冲液选择，特别是精确的pH调节和流速，对于在不影响精度或重复性的情况下进行生物制药分析的快速HPLC技术非常重要。例如，在最近的一项研究中，引入了一种快速尺寸排阻色谱-高效液相色谱（SEC-HPLC）定量方法，用于支持基于病毒的疗法的开发中的水疱性口炎病毒（VSV）颗粒定量。该方法涉及SEC和多角度光散射（MALS）与280 nm紫外检测，用于同时分离、定量和表征样品的大小。进行了缓冲液筛选，从含有50 mM NaCl和150 mM精氨酸（Arg）、pH调节至7.5的Tris基缓冲液开始。进行了若干修改，包括改变Tris缓冲液的盐含量、改变Tris缓冲液中Arg的浓度和pH、测试柠檬酸盐和磷酸盐缓冲溶液、结合Arg和盐浓度修改的Tris缓冲液，以及含有添加剂（山梨醇、蔗糖、二甲基亚砜[DMSO]）的Tris缓冲液。最终，优化的缓冲液条件（50 mM Tris, 200 mM NaCl, 150 mM精氨酸, 0.1% DMSO, pH 8.0）通过最大限度地减少与SEC树脂的非特异性相互作用，确保了优异的回收率（>97%）。病毒颗粒在约10.2分钟时作为排阻峰洗脱，与蛋白质杂质分离良好，保证了快速周转、简便的操作程序和可靠的性能。

另一项研究通过优化HPLC参数，开发了一种快速、精确、稳定的RP-HPLC技术，用于定量聚合物纳米粒制剂中的布舍瑞林乙酸酯（BA）。作者采用系统的分析质量源于设计（AQbD）方法，包括风险评估和实验设计，证明流速和缓冲液pH是关键方法参数，而保留时间和峰面积被确定为关键分析属性。遵循AQbD指南，通过使用水:乙腈（80:20, v/v），以正磷酸为改性剂，在Zorbax Eclipse plus C18色谱柱上，流速为1.0 ml/min，实现了最佳的色谱分离度。这使得能够在约6.8分钟的短保留时间内获得尖锐、分离良好的峰。所提出的方法提供了一种环保的方法，显著减少了溶剂使用，并以水作为流动相的主要组成部分。

用于快速HPLC的色谱柱进展

色谱柱通常被称为色谱分离的“心脏”，它基于选择性和性能促进化合物的分离。为了促进快速HPLC，HPLC色谱柱技术已经取得了一些进展。这些新设计的色谱柱填充有全多孔、核壳颗粒、整体柱结构和其他创新形式。每种类型在效率、分辨率、反压和适用于快速或高通量HPLC方面提供独特的优势。

选择具有合适尺寸、颗粒技术和固定相（适合分析物类型）的色谱柱对于开发快速、高效和可靠的HPLC方法至关重要。基于固定相化学的色谱柱选择性显著影响目标分析物的快速分离和分辨率。具有特殊相（如C4和苯基）的色谱柱可以提高对生物分子的选择性，从而减少对长或复杂梯度的需求。此外，温度稳定性和柱径也影响HPLC方法的速度和灵敏度。通常，窄径柱可以提高温度稳定性，增加灵敏度，并减少溶剂使用，这对生物分析测定很有帮助。在过去的十年中，逐步的创新使得第二代硅胶整体柱成为蛋白质分离、抗生素定量和生物分析血浆测定的快速且经济高效的理想选择。整体柱具有连续的多孔结构，具有相互连接的大孔和中孔，这与传统填充柱中紧密堆积的硅胶颗粒的结构截然不同。这种结构允许对流流动，从而提供高渗透性和低反压。因此，整体柱可以在高流速（高达10 mL/min）下使用，而不会影响分辨率和色谱性能。它们精细的孔结构极大地减少了谱带展宽，提高了峰对称性，并显著提高了柱效，即使在超快速运行期间也能产生高塔板数（>140,000 plates/meter）。第二代整体柱的这些特性使其适用于快速发展的制药工作流程，其中速度、灵敏度和成本效益至关重要。

超短HPLC色谱柱，长度通常在2至20毫米之间，正被广泛用于高通量和快速分析。这类超短色谱柱能够将分析时间急剧缩短至不到一分钟，且不牺牲分离质量，这已导致有趣的生物分析应用。通常，超短色谱柱填充有更短的固定相，如小粒径或核壳颗粒，导致更低的压降和更有效的分离，且死体积最小，从而达到最佳效果。现在，用于IEX、HILIC和快速RP色谱的具有尺寸（20 * 2.1mm）的超短柱已经问世。短核壳颗粒色谱柱技术的最新发展凸显了对快速方法日益增长的兴趣，旨在实现快速分离和缩短分析时间，同时不损失分辨率或灵敏度。改进的C18柱化学物质，基于表面多孔颗粒（SPP）平台，专为极性和非极性化合物的快速、选择性分离而设计。另一方面，对于像抗体这样的大分子分析，宽孔整体柱由于其独特的大孔结构，能够实现快速的蛋白质分离，并具有高效率和结构完整性。基因治疗和mRNA疫苗等生物制药形态的复杂结构和制造过程需要复杂的分析方法。大生物分子在LC系统金属表面的非特异性吸附使分析复杂化。为了克服这些限制，现代HPLC系统中对色谱柱颗粒和流路元件都采用了低吸附性和惰性硬件涂层等表面修饰。采用低吸附涂层（如混合硅胶-有机基质、Ti和PEEK）掩蔽的色谱柱显著减少了由于吸附造成的分析物损失，这是非常理想的。因此，在蛋白质、肽和生物制药的快速和高通量分析中，此类色谱柱可提供更好的样品回收率和峰形。此外，分析物与活性位点相互作用的减少增强了方法的稳健性，减少了残留，并提高了灵敏度；从而保证了超短色谱柱和最先进的检测在具有挑战性的工作流程中的可靠应用。

一项研究引入了一种新方法，以实现超快速反相液相色谱（RPLC），用于分析复杂的治疗性蛋白质，特别是双特异性非共价构建体。脆弱且复杂的蛋白质结构，如双特异性同源二聚体和同源四聚体，需要更高的温度才能完全解离并以单体形式洗脱。然而，这增加了柱上降解的可能性，可能导致假峰和纯度谱的误解。为了解决这个问题，新方法将过热色谱条件（高达110°C）与非常短的色谱柱（短至10毫米）相结合，而标准色谱柱为100毫米。这种设置允许在短短1到4分钟内实现快速分离。因此，使用超热超短柱的超快速液相色谱可以有效且实用地快速分析复杂的治疗性蛋白质。在生物分析应用中，特别是在涉及单抗和蛋白质治疗药物分析时，使用基于混合硅胶的色谱柱进行SEC和HILIC快速分析正变得越来越普遍。这些色谱柱填充有混合有机-无机硅胶颗粒，结合了硅胶的机械强度和改善的化学稳定性，从而降低了硅醇基活性。这种设计有利于水性SEC和HILIC分离，因为它减少了与生物分子的非特异性疏水和静电相互作用，这些相互作用会对分离产生不利影响。在另一个最近发表的应用中，一种快速高效的尺寸排阻色谱（SEC）方法被用于快速分析治疗性单抗的尺寸变体。所提出的方法使用较短的色谱柱，用于UPLC的SEC 250 ?, 1.7 μm, 4.6 × 150 mm和用于HPLC兼容的SEC 250 ?, 2.5 μm, 4.6 × 150 mm。虽然传统的SEC方法通常每次运行需要20到30分钟，但所提出的快速SEC方法将分析时间减少到每次运行2.1到3.0分钟，且不牺牲分辨率，在聚集体和片段的峰形和定量方面表现出优异的一致性。对于贝伐珠单抗/曲妥珠单抗，最小样品进样量约为1至3 μL，对于英夫利昔单抗/利妥昔单抗，为2至6 μL，这种快速SEC方法可以促进高通量任务，如实时质量控制、制剂筛选和生物类似药可比性研究，其中速度和准确性至关重要。

自20世纪70年代以来，液相色谱经历了显著的演变，随着当今填充有亚2 μm颗粒的色谱柱和UHPLC的出现，效率几乎达到了完全的理论值。然而，随着颗粒变小，填充柱开始受到基本物理限制的影响，如涡流扩散（多路径效应）和高反压。最近，微柱阵列色谱柱（μPAC）提供了一个实用的解决方案。这些色谱柱采用微电子技术制造，创建精确对齐的微柱（直径5 μm，间距2.5 μm），提供极其均匀、可重复的流路，并减少了由涡流扩散引起的分散。因此，μPAC正在成为一种尖端的HPLC技术，可实现生物治疗药物（包括蛋白质、抗体和寡核苷酸）的快速可靠分析。与传统的填充柱相比，开放结构提供了显著更低的反压、快速的样品加载，使得能够使用更长的色谱柱以实现高分辨率，以及更高的流速以实现快速分析，而不会超过仪器限制。现在，μPAC色谱柱可用于纳流、毛细管和微流LC设置（通常高达15 μL/min），满足稳健的常规生产分析和极其灵敏的组学测定的要求。

HPLC设备的进展

HPLC设备的创新对于执行快速HPLC方法至关重要，因为它们直接影响分析的速度、准确性和可靠性。泵、检测器、自动进样器的性能以及系统耐压性都对快速方法（尤其是高通量或复杂生物制药分析）的运行效果非常重要。具有低内部体积和精确温度控制的设备提高了保留时间的稳定性和峰的一致性。检测器响应速度是另一个重要因素。在具有窄峰的快速方法中，检测器需要足够快地采样数据点以准确捕获峰的形状和面积。因此，优化设备参数是开发快速方法的关键步骤。液相色谱与质谱（MS）的联用也增强了分析能力；本综述主要强调HPLC的发展，不讨论基于MS的快速方法开发进展。

超高效液相色谱（UHPLC）已成为首选的现代HPLC平台，十多年来能够以低反压处理高流速。UPLC适用于直径小于2μm的颗粒。它在更高的压力下运行，高达15,000 psi，这有助于实现比HPLC更好的分辨率、速度和更尖锐的峰。UHPLC具有更高的灵敏度和更低的检测限，使其成为痕量水平分析的理想选择。它提高了色谱效率，降低了溶剂使用，并提高了样品通量。这种高通量设备与成熟的标准检测方法（如紫外（UV）、光电二极管阵列（PDA）和质谱（MS））良好配对，增强了其在识别和研究复杂生物分子中的作用。在发现和开发阶段，生物样品中蛋白质治疗药物的准确定量和蛋白质的定性分析是两个主要目标。过程分析技术（PAT）在这方面变得至关重要，实现了过程控制、更高的产品产量和增强的质量。与基于LC的技术集成的在线采样提供了实时监测能力，最大限度地减少了样品操作，并将周转时间从几天缩短到几分钟。虽然基于光谱的PAT工具，如拉曼和红外，提供在线、非侵入性监测，但它们不具备详细CQA评估所需的分子特异性。在PAT框架内的快速HPLC分析可以支持生物加工中的实时决策，特别是在色谱层析中的收集决策。传统上，收集决策依赖于280 nm的紫外吸光度，这无法区分产品和杂质。

数据分析的进展

数据分析正日益用于快速HPLC方法开发，因为它允许更快、更智能、更明智的决策。在分析方法开发过程中，需要同时优化多个变量，如流速、梯度斜率、色谱柱类型和温度。数据分析使研究人员能够使用实验设计（DoE）等工具有效识别重要参数。这显著减少了所需的实验次数，节省了时间和资源。此外，分析软件有助于识别HPLC色谱数据中的模式、趋势和变化。这有助于早期识别问题，如峰变形或保留时间漂移。建模技术和高级软件为复杂或大型数据集提供更快的数据分析。在生物制药分析方法开发过程中，结合质量源于设计（QbD）原则的混合机理-经验建模可以大幅减少时间、费用和实验工作量。总体而言，数据分析提高了快速方法开发的效率、准确性和可靠性，使其在现代生物制药分析中至关重要。

除了常用软件外，还推出了Agilent OpenLab CDS 2.2、Agilent OpenLab CDS ChemStation、Thermo Scientific Chromeleon 7.2 SR5 CDS和S-Matrix Fusion QbD 9.8.0等。这些软件配备了新的模拟色谱图可视化和报告功能，用户可以实时显示模拟色谱图，符合QbD和DOE概念。Molnár Institute DryLab 4.3是另一个非常受欢迎的HPLC方法开发软件，有助于色谱柱筛选、色谱柱比较和流速变化的预测。它也可用于多段预测和自动峰跟踪，并整合了选定供应商的LC数据。最近，一项研究描述了一种用于全自动HPLC方法开发的新闭环方法。传统的基于DOE的模拟路径（DryLab, ACD/LC Simulator, ChromSword）需要人工进行峰标记和模型验证，从而使方法开发成为资源密集型活动。相比之下，该方法将HPLC仪器与MATLAB-Excel自动化和贝叶斯优化算法集成，实现了真正的操作员免费优化。使用单目标（BOAEI）和多目标（TS-EMO）程序，快速优化了三个关键的色谱变量，即初始有机改性剂浓度、等度保持时间和梯度时间。考虑的色谱图质量指标包括峰数量、分辨率和运行时间。虽然BOAEI更快，但TS-EMO通过指出冲突目标之间的帕累托最优权衡找到了更稳健的解决方案，从而允许在不重新优化的情况下更改接受标准。

使用HPLC进行传统样品分析，特别是使用UV和荧光检测，常用于分析蛋白质、代谢物和糖链。然而，它通常需要使用传统的HPLC软件工具进行耗时的手动数据处理。在过去几年中，研究人员专注于提高HPLC的通量，但现在焦点已开始从实验阶段（如糖链释放和样品制备）的瓶颈转向数据分析阶段。随着对大规模研究需求的增长，对高效、自动化数据分析工具的需求非常强烈。

快速HPLC方法开发和实施过程中面临的挑战

尽管快速HPLC方法在速度、效率和通量方面具有明显优势，但也存在若干挑战。一个主要问题是在与传统工作流程相比保持速度的同时不牺牲分辨率。更快的分离通常可能妨碍区分紧密洗脱的峰，尤其是在复杂混合物中。例如，使用短柱或陡梯度可能会影响峰分辨率和特异性，并降低样品上样量，使得难以分析稀释或基质丰富的样品。仪器兼容性是另一个限制，特别是在方法验证期间，因为并非所有系统都构建为能够管理超快速方法所需的快速梯度变化或高数据采集速率。快速方法通常对温度、流动相组成和进样体积的变化更敏感。当使用过热条件（例如在蛋白质分离中）时，需要仔细的方法设计以避免热降解和不需要的峰形成。最后，基质效应在快速条件下可能会恶化，导致共洗脱或峰形扭曲。优化这些方法通常需要使用DryLab等专用软件，这可能并非每个实验室都可用。

结论与未来展望

在生物制药分析中实施快速HPLC方法可以节省时间和精力，减少产品降解和污染的可能性。本文综述了过去6年（2019-2025年）在蛋白质（包括单抗、ADCs和其他治疗性蛋白）快速色谱分析方面的主要进展。讨论的方面包括色谱设备、色谱柱创新和先进方法学，这些都有助于快速HPLC方法在生物制药行业中的实施。每个参数都通过案例研究进行了说明，以阐述在常规生物治疗分析中对快速HPLC日益增长的需求。虽然超快速HPLC在生物制药开发、质量控制、放行检验和资源效率方面提供了快速分析、高通量和快速决策的能力，但与解析高度复杂的生物治疗药物、稳健性和监管接受度相关的局限性使其更适合用于筛选和早期开发，而不是质量控